304 स्टेनलेस स्टील वेल्डेड कुंडलित ट्यूब / ट्यूबिंग ज़ेमिकल ज़ोम्पोनेंट, वैश्विक समुद्री माइक्रोबायोम की बायोसिंथेटिक क्षमता

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विस्तृत उत्पाद विवरण

304 स्टेनलेस स्टील वेल्डेड कुंडलित ट्यूब/टयूबिंग
1. विशिष्टता: स्टेनलेस स्टील कॉइल ट्यूब / ट्यूबिंग
2. प्रकार: वेल्डेड या सीमलेस
3. मानक: एएसटीएम ए269, एएसटीएम ए249
4. स्टेनलेस स्टील कॉइल ट्यूब OD: 6 मिमी से 25.4 मिमी
5. लंबाई: 600-3500MM या ग्राहक की आवश्यकता के अनुसार।
6. दीवार की मोटाई: 0.2 मिमी से 2.0 मिमी।

7. सहनशीलता: OD: +/-0.01mm;मोटाई: +/-0.01%.

8. कुंडल भीतरी छेद का आकार: 500MM-1500MM (ग्राहकों की आवश्यकताओं के अनुसार समायोजित किया जा सकता है)

9. कुंडल ऊंचाई: 200MM-400MM (ग्राहकों की आवश्यकताओं के अनुसार समायोजित किया जा सकता है)

10. सतह: चमकदार या एनील्ड
11. सामग्री: 304, 304L, 316L, 321, 301, 201, 202, 409, 430, 410, मिश्र धातु 625, 825, 2205, 2507, आदि।
12. पैकिंग: लकड़ी के केस, लकड़ी के फूस, लकड़ी के शाफ्ट, या ग्राहक की आवश्यकता के अनुसार बुने हुए बैग
13. परीक्षण: रासायनिक घटक, उपज शक्ति, तन्य शक्ति, कठोरता माप
14. गारंटी: तृतीय पक्ष (उदाहरण के लिए: एसजीएस टीवी) निरीक्षण, आदि।
15. अनुप्रयोग: सजावट, फर्नीचर, तेल परिवहन, हीट एक्सचेंजर, रेलिंग बनाना, कागज बनाना, ऑटोमोबाइल, खाद्य प्रसंस्करण, चिकित्सा, आदि।

प्राकृतिक सूक्ष्मजीव समुदाय फ़ाइलोजेनेटिक और चयापचय रूप से विविध हैं।जीवों1 के अध्ययन किए गए समूहों के अलावा, यह विविधता पारिस्थितिक और जैव-तकनीकी रूप से महत्वपूर्ण एंजाइमों और जैव रासायनिक यौगिकों2,3 की खोज के लिए भी समृद्ध क्षमता रखती है।हालाँकि, ऐसे यौगिकों को संश्लेषित करने और उन्हें उनके संबंधित मेजबानों से बांधने वाले जीनोमिक मार्गों को निर्धारित करने के लिए इस विविधता का अध्ययन करना एक चुनौती बनी हुई है।वैश्विक स्तर पर संपूर्ण जीनोम रिज़ॉल्यूशन डेटा के विश्लेषण में सीमाओं के कारण खुले महासागर में सूक्ष्मजीवों की जैवसंश्लेषण क्षमता काफी हद तक अज्ञात बनी हुई है।यहां, हम 1,000 से अधिक समुद्री जल नमूनों से 25,000 से अधिक नए पुनर्निर्मित ड्राफ्ट जीनोम के साथ संवर्धित कोशिकाओं और एकल कोशिकाओं से लगभग 10,000 माइक्रोबियल जीनोम को एकीकृत करके समुद्र में जैवसंश्लेषक जीन समूहों की विविधता और विविधता का पता लगाते हैं।इन प्रयासों ने लगभग 40,000 अनुमानित नए बायोसिंथेटिक जीन समूहों की पहचान की है, जिनमें से कुछ पहले से अप्रत्याशित फ़ाइलोजेनेटिक समूहों में पाए गए हैं।इन आबादी में, हमने जैवसंश्लेषक जीन समूहों ("कैंडिडैटस यूडोर्माइक्रोबियासी") से समृद्ध एक वंश की पहचान की, जो एक अप्रयुक्त जीवाणु फ़ाइलम से संबंधित था और इसमें इस वातावरण में सबसे अधिक जैवसंश्लेषक रूप से विविध सूक्ष्मजीव शामिल थे।इनमें से, हमने क्रमशः असामान्य बायोएक्टिव यौगिक संरचना और एंजाइमोलॉजी के उदाहरणों की पहचान करते हुए, फॉस्फेट-पेप्टाइड और पायटोनमाइड मार्गों की विशेषता बताई है।निष्कर्ष में, यह अध्ययन दर्शाता है कि कैसे माइक्रोबायोम-आधारित रणनीतियाँ खराब समझे गए माइक्रोबायोटा और पर्यावरण में पहले से वर्णित एंजाइमों और प्राकृतिक खाद्य पदार्थों की खोज को सक्षम कर सकती हैं।
सूक्ष्मजीव वैश्विक जैव-भू-रासायनिक चक्र चलाते हैं, खाद्य जाल बनाए रखते हैं, और पौधों और जानवरों को स्वस्थ रखते हैं5।उनकी विशाल फ़ाइलोजेनेटिक, चयापचय और कार्यात्मक विविधता प्राकृतिक उत्पादों6 सहित नए टैक्सा1, एंजाइमों और जैव रासायनिक यौगिकों की खोज के लिए एक समृद्ध क्षमता का प्रतिनिधित्व करती है।पारिस्थितिक समुदायों में, ये अणु सूक्ष्मजीवों को संचार से लेकर प्रतिस्पर्धा 2, 7 तक विभिन्न प्रकार के शारीरिक और पारिस्थितिक कार्य प्रदान करते हैं।अपने मूल कार्यों के अलावा, ये प्राकृतिक उत्पाद और उनके आनुवंशिक रूप से कोडित उत्पादन मार्ग जैव प्रौद्योगिकी और चिकित्सीय अनुप्रयोगों2,3 के लिए उदाहरण प्रदान करते हैं।सुसंस्कृत सूक्ष्मजीवों के अध्ययन से ऐसे मार्गों और कनेक्शनों की पहचान में काफी मदद मिली है।हालाँकि, प्राकृतिक वातावरण के वर्गीकरण अध्ययनों से पता चला है कि अधिकांश सूक्ष्मजीवों की खेती नहीं की गई है8।यह सांस्कृतिक पूर्वाग्रह कई रोगाणुओं4,9 द्वारा एन्कोड की गई कार्यात्मक विविधता का फायदा उठाने की हमारी क्षमता को सीमित करता है।
इन सीमाओं को दूर करने के लिए, पिछले दशक में तकनीकी प्रगति ने शोधकर्ताओं को पूरे समुदायों (मेटागेनोमिक्स) या एकल कोशिकाओं से माइक्रोबियल डीएनए टुकड़ों को सीधे (यानी, पूर्व संस्कृति के बिना) अनुक्रमित करने की अनुमति दी है।इन टुकड़ों को बड़े जीनोम टुकड़ों में इकट्ठा करने और क्रमशः कई मेटाजेनॉमिक रूप से इकट्ठे जीनोम (एमएजी) या एकल प्रवर्धित जीनोम (एसएजी) का पुनर्निर्माण करने की क्षमता, माइक्रोबायोम (यानी, माइक्रोबियल समुदायों और माइक्रोबायोम) के टैक्सोसेंट्रिक अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण अवसर खोलती है।नये पथ प्रशस्त करें.किसी दिए गए वातावरण में स्वयं की आनुवंशिक सामग्री) 10,11,12।दरअसल, हाल के अध्ययनों ने पृथ्वी 1, 13 पर माइक्रोबियल विविधता के फ़ाइलोजेनेटिक प्रतिनिधित्व का काफी विस्तार किया है और व्यक्तिगत माइक्रोबियल समुदायों में कार्यात्मक विविधता का खुलासा किया है जो पहले सुसंस्कृत सूक्ष्मजीव संदर्भ जीनोम अनुक्रम (आरईएफ) 14 द्वारा कवर नहीं किया गया था।मेजबान जीनोम (यानी, जीनोम रिज़ॉल्यूशन) के संदर्भ में अनदेखे कार्यात्मक विविधता को रखने की क्षमता अभी तक अचिह्नित माइक्रोबियल लाइनों की भविष्यवाणी करने के लिए महत्वपूर्ण है जो संभवतः नए प्राकृतिक उत्पादों को एनकोड करती है या ऐसे यौगिकों को उनके मूल उत्पादक में वापस लाने के लिए पता लगाती है।उदाहरण के लिए, एक संयुक्त मेटागेनोमिक और एकल-कोशिका जीनोमिक विश्लेषण दृष्टिकोण ने कैंडिडैटस एंटोथेनेला की पहचान की है, जो मेटाबॉलिक रूप से समृद्ध स्पंज से जुड़े बैक्टीरिया का एक समूह है, जो विभिन्न प्रकार की दवा संभावनाओं के उत्पादक के रूप में है।हालाँकि, विविध माइक्रोबियल समुदायों के जीनोमिक अन्वेषण के हालिया प्रयासों के बावजूद, पृथ्वी के पारिस्थितिक तंत्र के सबसे बड़े महासागर16,20 के लिए वैश्विक मेटागेनोमिक डेटा का दो-तिहाई से अधिक अभी भी गायब है।इस प्रकार, सामान्य तौर पर, समुद्री माइक्रोबायोम की जैवसंश्लेषक क्षमता और नवीन एंजाइमैटिक और प्राकृतिक उत्पादों के भंडार के रूप में इसकी क्षमता का काफी हद तक अध्ययन नहीं किया गया है।
वैश्विक स्तर पर समुद्री माइक्रोबायोम की जैवसंश्लेषक क्षमता का पता लगाने के लिए, हमने सबसे पहले फ़ाइलोजेनेटिक्स और जीन फ़ंक्शन का एक व्यापक डेटाबेस बनाने के लिए संस्कृति-निर्भर और गैर-संस्कृति तरीकों का उपयोग करके प्राप्त समुद्री माइक्रोबियल जीनोम को एकत्रित किया।इस डेटाबेस की जांच से विभिन्न प्रकार के बायोसिंथेटिक जीन क्लस्टर (बीजीसी) का पता चला, जिनमें से अधिकांश अभी तक अचिह्नित जीन क्लस्टर (जीसीएफ) परिवारों से संबंधित हैं।इसके अलावा, हमने एक अज्ञात जीवाणु परिवार की पहचान की है जो खुले महासागर में आज तक बीजीसी की सबसे अधिक ज्ञात विविधता प्रदर्शित करता है।हमने वर्तमान में ज्ञात मार्गों से उनके आनुवंशिक अंतर के आधार पर प्रयोगात्मक सत्यापन के लिए दो राइबोसोमल संश्लेषण और पोस्ट-ट्रांसलेशनली संशोधित पेप्टाइड (आरआईपीपी) मार्गों का चयन किया।इन मार्गों के कार्यात्मक लक्षण वर्णन से एंजाइम विज्ञान के अप्रत्याशित उदाहरणों के साथ-साथ प्रोटीज निरोधात्मक गतिविधि के साथ संरचनात्मक रूप से असामान्य यौगिकों का पता चला है।
सबसे पहले, हमारा लक्ष्य जीनोम विश्लेषण के लिए एक वैश्विक डेटा संसाधन बनाना था, जो इसके जीवाणु और पुरातन घटकों पर ध्यान केंद्रित करता था।इस उद्देश्य के लिए, हमने विश्व स्तर पर वितरित 215 नमूना स्थलों (अक्षांश सीमा = 141.6°) और कई गहरी परतों (1 से 5600 मीटर की गहराई तक, पेलजिक, मेसोपेलैजिक और एबिसल जोन को कवर करते हुए) से मेटागेनोमिक डेटा और 1038 समुद्री जल के नमूने एकत्र किए।पृष्ठभूमि21,22,23 (चित्र 1ए, विस्तारित डेटा, चित्र 1ए और अनुपूरक तालिका 1)।व्यापक भौगोलिक कवरेज प्रदान करने के अलावा, इन चुनिंदा फ़िल्टर किए गए नमूनों ने हमें समुद्री माइक्रोबायोम के विभिन्न घटकों की तुलना करने की अनुमति दी, जिसमें वायरस-समृद्ध (<0.2 µm), प्रोकैरियोटिक-समृद्ध (0.2-3 µm), कण-समृद्ध (0.8 µm) शामिल हैं। ).-20 µm) और वायरस-रहित (>0.2 µm) कॉलोनियाँ।
ए, विश्व स्तर पर वितरित 215 स्थानों (62° दक्षिण से 79° उत्तर और 179° पश्चिम से 179° पूर्व) से समुद्री माइक्रोबियल समुदायों के कुल 1038 सार्वजनिक रूप से उपलब्ध जीनोम (मेटागेनोमिक्स) एकत्र किए गए।मानचित्र टाइलें © Esri.स्रोत: GEBCO, NOAA, CHS, OSU, UNH, CSUMB, नेशनल ज्योग्राफिक, DeLorme, NAVTEQ, और Esri।बी, इन मेगाहेनजोम का उपयोग एमएजी (विधियों और अतिरिक्त जानकारी) के पुनर्निर्माण के लिए किया गया था, जो डेटासेट (रंग में चिह्नित) में मात्रा और गुणवत्ता (विधियों) में भिन्न होते हैं।पुनर्निर्मित एमएजी को हस्तनिर्मित एमएजी26, एसएजी27 और आरईएफ सहित सार्वजनिक रूप से उपलब्ध (बाहरी) जीनोम के साथ पूरक किया गया था।27 ओएमडी संकलित करें।सी, केवल एसएजी (जीओआरजी)20 या एमएजी (जीईएम)16 पर आधारित पिछली रिपोर्टों की तुलना में, ओएमडी गहराई में अधिक सुसंगत प्रतिनिधित्व के साथ समुद्री माइक्रोबियल समुदायों (मेटागेनोमिक रीड मैपिंग दर; विधि) के जीनोमिक लक्षण वर्णन में दो से तीन गुना सुधार करता है और अक्षांश..<0.2, n=151, 0.2-0.8, n=67, 0.2-3, n=180, 0.8-20, n=30, >0.2, n=610, <30°, n = 132, 30-60° , n = 73, >60°, n = 42, EPI, n = 174, MES, n = 45, BAT, n = 28. d, प्रजातियों के समूहों के स्तर में OMD समूहीकरण (95% माध्य न्यूक्लियोटाइड पहचान) कुल की पहचान करता है लगभग 8300 प्रजातियाँ, जिनमें से आधे से अधिक को पहले जीटीडीबी (संस्करण 89) ई का उपयोग करके टैक्सोनोमिक एनोटेशन के अनुसार चित्रित नहीं किया गया है, जीनोम प्रकार द्वारा प्रजातियों के वर्गीकरण से पता चला है कि एमएजी, एसएजी और आरईएफ फ़ाइलोजेनेटिक विविधता को प्रतिबिंबित करने में एक दूसरे के पूरक हैं। समुद्री माइक्रोबायोम.विशेष रूप से, 55%, 26% और 11% प्रजातियाँ क्रमशः एमएजी, एसएजी और आरईएफ के लिए विशिष्ट थीं।बैट्स, बरमूडा अटलांटिक टाइम सीरीज़;जीईएम, पृथ्वी के माइक्रोबायोम के जीनोम;GORG, वैश्विक महासागर संदर्भ जीनोम;हॉट, हवाईयन महासागर समय श्रृंखला।
इस डेटासेट का उपयोग करके, हमने कुल 26,293 एमएजी का पुनर्निर्माण किया, जिनमें ज्यादातर बैक्टीरिया और आर्कियल (चित्र 1 बी और विस्तारित डेटा, चित्र 1 बी) थे।हमने अलग-अलग स्थानों या समय बिंदुओं (विधियों) से नमूनों के बीच प्राकृतिक अनुक्रम भिन्नता के पतन को रोकने के लिए पूल किए गए मेटागेनोमिक नमूनों के बजाय अलग-अलग असेंबली से इन एमएजी का निर्माण किया।इसके अलावा, हमने बड़ी संख्या में नमूनों (58 से 610 नमूनों तक, सर्वेक्षण; विधि के आधार पर) में उनके व्यापकता सहसंबंधों के आधार पर जीनोमिक टुकड़ों को समूहीकृत किया।हमने पाया कि यह एक समय लेने वाला लेकिन महत्वपूर्ण कदम है जिसे कई बड़े पैमाने पर MAG16, 19, 25 पुनर्निर्माण कार्यों में छोड़ दिया गया था और मात्रा (औसतन 2.7 गुना) और गुणवत्ता (औसतन + 20%) में काफी सुधार हुआ है। जीनोम.यहां अध्ययन किए गए समुद्री मेटागेनोम से पुनर्निर्माण किया गया (विस्तारित डेटा, चित्र 2ए और अतिरिक्त जानकारी)।कुल मिलाकर, इन प्रयासों के परिणामस्वरूप आज उपलब्ध सबसे व्यापक एमएजी संसाधन16 (तरीके) की तुलना में समुद्री माइक्रोबियल एमएजी में 4.5 गुना (केवल उच्च गुणवत्ता वाले एमएजी पर विचार किया जाए तो 6 गुना) वृद्धि हुई है।इस नव निर्मित एमएजी सेट को तब 830 हाथ से चुने गए एमएजी26, 5969 एसएजी27 और 1707 आरईएफ के साथ जोड़ा गया था।समुद्री बैक्टीरिया और आर्किया की सत्ताईस प्रजातियों ने 34,799 जीनोम (छवि 1 बी) का एक संयोजन संग्रह बनाया।
फिर हमने समुद्री सूक्ष्मजीव समुदायों का प्रतिनिधित्व करने की क्षमता में सुधार करने और विभिन्न जीनोम प्रकारों को एकीकृत करने के प्रभाव का आकलन करने के लिए नव निर्मित संसाधन का मूल्यांकन किया।औसतन, हमने पाया कि यह लगभग 40-60% समुद्री मेटागेनोमिक डेटा (चित्र 1सी) को कवर करता है, जो गहराई और अक्षांश दोनों में पिछली एमएजी-केवल रिपोर्ट की कवरेज से दो से तीन गुना अधिक है, अधिक सीरियल 16 या एसएजी20।इसके अलावा, स्थापित संग्रहों में टैक्सोनोमिक विविधता को व्यवस्थित रूप से मापने के लिए, हमने जीनोम टैक्सोनॉमी डेटाबेस (जीटीडीबी) टूलकिट (विधियों) का उपयोग करके सभी जीनोमों को एनोटेट किया और 95% की औसत जीनोम-वाइड न्यूक्लियोटाइड पहचान का उपयोग किया।28 8,304 प्रजाति समूहों (प्रजातियों) की पहचान करने के लिए।इनमें से दो-तिहाई प्रजातियाँ (नए समूहों सहित) पहले जीटीडीबी में दिखाई नहीं दी थीं, जिनमें से 2790 को इस अध्ययन में पुनर्निर्मित एमएजी का उपयोग करके खोजा गया था (चित्र 1डी)।इसके अलावा, हमने पाया कि विभिन्न प्रकार के जीनोम अत्यधिक पूरक हैं: 55%, 26% और 11% प्रजातियाँ क्रमशः पूरी तरह से एमएजी, एसएजी और आरईएफ से बनी हैं (चित्र 1ई)।इसके अलावा, एमएजी ने जल स्तंभ में पाए जाने वाले सभी 49 प्रकारों को कवर किया, जबकि एसएजी और आरईएफ ने क्रमशः उनमें से केवल 18 और 11 का प्रतिनिधित्व किया।हालाँकि, SAG सबसे आम समूहों (विस्तारित डेटा, चित्र 3a) की विविधता का बेहतर प्रतिनिधित्व करता है, जैसे कि पेलजिक बैक्टीरिया (SAR11), जिसमें SAG लगभग 1300 प्रजातियों और MAG केवल 390 प्रजातियों को कवर करता है।विशेष रूप से, आरईएफ शायद ही कभी प्रजातियों के स्तर पर एमएजी या एसएजी के साथ ओवरलैप होते हैं और यहां अध्ययन किए गए खुले महासागर मेटागेनोमिक सेटों में नहीं पाए जाने वाले लगभग 1000 जीनोम में से 95% का प्रतिनिधित्व करते हैं, मुख्य रूप से अन्य प्रकार के पृथक प्रतिनिधि समुद्री नमूनों (जैसे तलछट) के साथ बातचीत के कारण। .या मेज़बान-सहयोगी)।इसे वैज्ञानिक समुदाय के लिए व्यापक रूप से उपलब्ध कराने के लिए, इस समुद्री जीनोम संसाधन, जिसमें अवर्गीकृत टुकड़े भी शामिल हैं (उदाहरण के लिए, अनुमानित चरण, जीनोमिक द्वीप और जीनोम टुकड़े जिनके लिए एमएजी पुनर्निर्माण के लिए अपर्याप्त डेटा है), की तुलना टैक्सोनोमिक डेटा से की जा सकती है। .महासागर माइक्रोबायोलॉजी डेटाबेस (ओएमडी; https://microbiomics.io/ocean/) में जीन फ़ंक्शन और प्रासंगिक मापदंडों के साथ एनोटेशन तक पहुंचें।
फिर हम खुले समुद्र के माइक्रोबायोम में जैवसंश्लेषक क्षमता की समृद्धि और नवीनता का पता लगाने के लिए निकल पड़े।इस प्रयोजन के लिए, हमने सबसे पहले कुल 39,055 बीजीसी की भविष्यवाणी करने के लिए 1038 समुद्री मेटागेनोम (विधियों) में पाए गए सभी एमएजी, एसएजी और आरईएफ के लिए एंटीस्मैश का उपयोग किया।फिर हमने अंतर्निहित अतिरेक (यानी, एक ही बीजीसी को कई जीनोम में एन्कोड किया जा सकता है) और केंद्रित बीजीसी के मेटाजेनोमिक डेटा विखंडन को ध्यान में रखते हुए इन्हें 6907 गैर-निरर्थक जीसीएफ और 151 जीन क्लस्टर आबादी (जीसीसी; अनुपूरक तालिका 2 और विधियों) में समूहीकृत किया।अपूर्ण बीजीसी में उल्लेखनीय वृद्धि नहीं हुई, यदि कोई हो (पूरक सूचना), क्रमशः जीसीएफ और जीसीसी की संख्या, जिसमें 44% और 86% मामलों में कम से कम एक अक्षुण्ण बीजीसी सदस्य शामिल है।
जीसीसी स्तर पर, हमें पूर्वानुमानित RiPPs और अन्य प्राकृतिक उत्पादों की एक विस्तृत विविधता मिली (चित्र 2a)।उनमें से, उदाहरण के लिए, एरिलपोलीन, कैरोटीनॉयड, एक्टोइन्स और साइडरोफोर्स एक व्यापक फ़ाइलोजेनेटिक वितरण और समुद्री मेटागेनोम में उच्च बहुतायत वाले जीसीसी से संबंधित हैं, जो प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के प्रतिरोध सहित समुद्री पर्यावरण में सूक्ष्मजीवों के व्यापक अनुकूलन का संकेत दे सकते हैं। ऑक्सीडेटिव और आसमाटिक तनाव।.या लौह अवशोषण (अधिक जानकारी)।यह कार्यात्मक विविधता एनसीबीआई रेफसेक डेटाबेस (बीआईजी-एफएएम/रेफसेक, इसके बाद रेफसेक के रूप में संदर्भित)29 में संग्रहीत लगभग 190,000 जीनोम के बीच लगभग 1.2 मिलियन बीजीसी के हालिया विश्लेषण के विपरीत है, जिससे पता चला है कि नॉनराइबोसोमल सिंथेटेज़ पेप्टाइड्स (एनआरपीएस) और पॉलीकेटाइड सिंथेज़ (पीकेएस) बीजीसी (पूरक सूचना)।हमने 44 (29%) जीसीसी भी पाए जो केवल किसी भी RefSeq BGC (\(\bar{d}\)RefSeq > 0.4; चित्र 2a और विधियों) से दूर से संबंधित हैं और 53 (35%) GCC केवल MAG में हैं, जो क्षमता को उजागर करते हैं। ओएमडी में पहले से वर्णित रसायनों का पता लगाने के लिए।यह देखते हुए कि इनमें से प्रत्येक जीसीसी संभवतः अत्यधिक विविध जैवसंश्लेषक कार्यों का प्रतिनिधित्व करता है, हमने समान प्राकृतिक उत्पादों29 के लिए कोड के लिए अनुमानित बीजीसी का अधिक विस्तृत समूह प्रदान करने के प्रयास में जीसीएफ स्तर पर डेटा का विश्लेषण किया।कुल 3861 (56%) पहचाने गए GCF RefSeq के साथ ओवरलैप नहीं हुए, और >97% GCF MIBiG में मौजूद नहीं थे, जो प्रयोगात्मक रूप से मान्य BGCs (चित्र 2बी) के सबसे बड़े डेटाबेस में से एक है।हालांकि उन सेटिंग्स में कई संभावित उपन्यास मार्गों की खोज करना आश्चर्यजनक नहीं है जो संदर्भ जीनोम द्वारा अच्छी तरह से प्रस्तुत नहीं किए गए हैं, बेंचमार्किंग से पहले बीजीसी को जीसीएफ में डीरेप्लिकेट करने की हमारी विधि पिछली रिपोर्ट 16 से भिन्न है और हमें नवीनता का निष्पक्ष मूल्यांकन प्रदान करने की अनुमति देती है।अधिकांश नई विविधता (3012 जीसीएफ या 78%) अनुमानित टेरपेन्स, आरआईपीपी या अन्य प्राकृतिक उत्पादों से मेल खाती है, और अधिकांश (1815 जीसीएफ या 47%) उनकी जैवसंश्लेषक क्षमता के कारण अज्ञात प्रकारों में एन्कोडेड है।पीकेएस और एनआरपीएस क्लस्टरों के विपरीत, इन कॉम्पैक्ट बीजीसी के मेटागेनोमिक असेंबली 31 के दौरान खंडित होने की संभावना कम होती है और वे अपने उत्पादों के अधिक समय और संसाधन-गहन कार्यात्मक लक्षण वर्णन की अनुमति देते हैं।
कुल 39,055 बीजीसी को 6,907 जीसीएफ और 151 जीसीसी में बांटा गया था।ए, डेटा प्रतिनिधित्व (आंतरिक बाहरी)।जीसीसी पर आधारित बीजीसी दूरियों की श्रेणीबद्ध क्लस्टरिंग, जिनमें से 53 केवल एमएजी द्वारा तय की जाती हैं।जीसीसी में विभिन्न टैक्सा (एलएन-रूपांतरित गेट आवृत्ति) और विभिन्न बीजीसी वर्गों (सर्कल का आकार इसकी आवृत्ति से मेल खाता है) से बीजीसी शामिल हैं।प्रत्येक GCC के लिए, बाहरी परत BiG-FAM से BGC तक BGCs की संख्या, व्यापकता (नमूनों का प्रतिशत), और दूरी (न्यूनतम BGC कोसाइन दूरी (न्यूनतम (dMIBiG))) का प्रतिनिधित्व करती है।प्रयोगात्मक रूप से सत्यापित बीजीसी (एमआईबीआईजी) से निकटता से संबंधित बीजीसी वाले जीसीसी को तीरों से हाइलाइट किया गया है।b पूर्वानुमानित (BiG-FAM) और प्रयोगात्मक रूप से मान्य (MIBiG) BGCs के साथ GCF की तुलना करने पर, 3861 नए (d–>0.2) GCF पाए गए।इनमें से अधिकांश (78%) कोड RiPP, टेरपेन्स और अन्य कथित प्राकृतिक उत्पादों के लिए हैं।सी, 1038 समुद्री मेटाजेनोम में पाए गए ओएमडी के सभी जीनोम को ओएमडी के फ़ाइलोजेनेटिक कवरेज को दिखाने के लिए जीटीडीबी बेस ट्री में रखा गया था।ओएमडी में बिना किसी जीनोम वाले क्लैड को ग्रे रंग में दिखाया गया है।बीजीसी की संख्या किसी दिए गए क्लैड में प्रति जीनोम अनुमानित बीजीसी की सबसे बड़ी संख्या से मेल खाती है।स्पष्टता के लिए, अंतिम 15% नोड्स ढह गए हैं।तीर माइकोबैक्टीरियम, गोर्डोनिया (रोडोकॉकस के बाद दूसरा), और क्रोकोस्फेरा (सिनेकोकोकस के बाद दूसरा) के अपवाद के साथ, बीजीसी (>15 बीजीसी) से समृद्ध समूहों को दर्शाते हैं।डी, अज्ञात सी.एरेमीओबैक्टीरोटा ने उच्चतम जैवसंश्लेषक विविधता (प्राकृतिक उत्पाद प्रकार पर आधारित शैनन सूचकांक) दिखाई।प्रत्येक बैंड प्रजातियों में सबसे अधिक बीजीसी वाले जीनोम का प्रतिनिधित्व करता है।टी1पीकेएस, पीकेएस टाइप I, टी2/3पीकेएस, पीकेएस टाइप II और टाइप III।
समृद्धि और नवीनता के अलावा, हम समुद्री माइक्रोबायोम की जैवसंश्लेषक क्षमता की जैव-भौगोलिक संरचना का पता लगाते हैं।औसत मेटागेनोमिक जीसीएफ कॉपी संख्या वितरण (तरीके) द्वारा नमूनों के समूहीकरण से पता चला कि कम अक्षांश, सतह, प्रोकैरियोटिक-समृद्ध और वायरस-गरीब समुदाय, ज्यादातर सतह या गहरे सूर्य के प्रकाश वाले पानी से, आरआईपीपी और बीजीसी टेरपेन्स में समृद्ध थे।इसके विपरीत, ध्रुवीय, गहरे समुद्र, वायरस और कण-समृद्ध समुदाय एनआरपीएस और पीकेएस बीजीसी (विस्तारित डेटा, चित्र 4 और अतिरिक्त जानकारी) की उच्च प्रचुरता से जुड़े थे।अंत में, हमने पाया कि अच्छी तरह से अध्ययन किए गए उष्णकटिबंधीय और पेलजिक समुदाय नए टेरपेन (संवर्धित डेटा चित्र) के सबसे आशाजनक स्रोत हैं।पीकेएस, आरआईपीपी और अन्य प्राकृतिक उत्पादों के लिए उच्चतम क्षमता (विस्तारित डेटा के साथ चित्र 5ए)।
समुद्री माइक्रोबायोम की जैवसंश्लेषक क्षमता के हमारे अध्ययन को पूरा करने के लिए, हमने उनके फ़ाइलोजेनेटिक वितरण को मैप करने और नए बीजीसी-समृद्ध समूहों की पहचान करने का लक्ष्य रखा है।इस उद्देश्य के लिए, हमने समुद्री रोगाणुओं के जीनोम को एक सामान्यीकृत जीटीडीबी13 बैक्टीरिया और आर्कियल फ़ाइलोजेनेटिक पेड़ में रखा और उनके द्वारा एन्कोड किए गए अनुमानित बायोसिंथेटिक मार्गों को ओवरलैप किया (चित्र 2 सी)।हमने समुद्री जल के नमूनों (विधियों) में कई बीजीसी-समृद्ध समूहों (15 से अधिक बीजीसी द्वारा प्रतिनिधित्व) का आसानी से पता लगाया है, जो अपनी जैवसंश्लेषक क्षमता के लिए जाने जाते हैं, जैसे कि सायनोबैक्टीरिया (सिंनेकोकोकस) और प्रोटियस बैक्टीरिया, जैसे टिस्ट्रेला32,33, या हाल ही में उनके लिए ध्यान आकर्षित किया है। प्राकृतिक उत्पाद ।जैसे कि मायक्सोकोकोटा (सैंडरासिनेसी), रोडोकोकस और प्लैंक्टोमाइसेटोटा34,35,36।दिलचस्प बात यह है कि हमें इन समूहों में पहले से अज्ञात कई वंशावली मिलीं।उदाहरण के लिए, फाइला प्लैंक्टोमाइसेटोटा और मायक्सोकोकोटा में सबसे समृद्ध जैवसंश्लेषक क्षमता वाली वे प्रजातियां क्रमशः अनचाहे उम्मीदवार ऑर्डर और जेनेरा से संबंधित थीं (पूरक तालिका 3)।कुल मिलाकर, इससे पता चलता है कि ओएमडी सूक्ष्मजीवों सहित पहले से अज्ञात फ़ाइलोजेनेटिक जानकारी तक पहुंच प्रदान करता है, जो एंजाइम और प्राकृतिक उत्पाद खोज के लिए नए लक्ष्यों का प्रतिनिधित्व कर सकता है।
इसके बाद, हमने बीजीसी-समृद्ध क्लैड की विशेषता न केवल इसके सदस्यों द्वारा एन्कोड किए गए बीजीसी की अधिकतम संख्या की गणना करके की, बल्कि इन बीजीसी की विविधता का आकलन करके भी की, जो विभिन्न प्रकार के प्राकृतिक उम्मीदवार उत्पादों (छवि 2 सी और विधियों) की आवृत्ति की व्याख्या करता है। )..हमने पाया कि इस अध्ययन में सबसे अधिक जैवसंश्लेषक रूप से विविध प्रजातियों का प्रतिनिधित्व विशेष रूप से इंजीनियर किए गए जीवाणु एमएजी द्वारा किया गया था।ये बैक्टीरिया असंवर्धित फ़ाइलम कैंडिडैटस एरेमीओबैक्टेरोटा से संबंधित हैं, जो कुछ जीनोमिक अध्ययनों के अलावा काफी हद तक अज्ञात है।उल्लेखनीय है कि “सीए.जीनस एरेमीओबैक्टीरोटा का विश्लेषण केवल स्थलीय वातावरण39 में किया गया है और बीजीसी में समृद्ध किसी भी सदस्य को शामिल करने के लिए ज्ञात नहीं है।यहां हमने एक ही प्रजाति (न्यूक्लियोटाइड पहचान> 99%) के आठ एमएजी का पुनर्निर्माण किया है 23. इसलिए हम प्रजाति का नाम "कैंडिडैटस यूडोरेमिक्रोबियम मालास्पिनि" प्रस्तावित करते हैं, जिसका नाम नेरीड (समुद्री अप्सरा) के नाम पर रखा गया है, जो ग्रीक पौराणिक कथाओं और अभियानों में एक सुंदर उपहार है।'का.फ़ाइलोजेनेटिक एनोटेशन 13 के अनुसार, ई. मैलास्पिनि का अनुक्रम स्तर से नीचे कोई पूर्व ज्ञात रिश्तेदार नहीं है और इस प्रकार यह एक नए जीवाणु परिवार से संबंधित है जिसे हम "सीए" प्रस्तावित करते हैं।ई. मालास्पिनि'' प्रकार की प्रजाति के रूप में और ''सीए.यूडोर्माइक्रोबियासी” आधिकारिक नाम के रूप में (पूरक सूचना)।'सीए' का संक्षिप्त मेटागेनोमिक पुनर्निर्माण।ई. मालास्पिनि जीनोम प्रोजेक्ट को बहुत कम इनपुट, लंबे समय तक पढ़े जाने वाले मेटागेनोमिक अनुक्रमण और 75 केबी दोहराव के साथ एकल 9.63 एमबी रैखिक गुणसूत्र के रूप में एकल नमूने (तरीकों) की लक्षित असेंबली द्वारा मान्य किया गया था।एकमात्र शेष अस्पष्टता के रूप में।
इस प्रजाति के फ़ाइलोजेनेटिक संदर्भ को स्थापित करने के लिए, हमने लक्षित जीनोम पुनर्निर्माण के माध्यम से तारा महासागर अभियान से अतिरिक्त यूकेरियोटिक-समृद्ध मेटागेनोमिक नमूनों में 40 निकट से संबंधित प्रजातियों की खोज की।संक्षेप में, हमने मेटागेनोमिक रीड्स को "सीए" से जुड़े जीनोमिक अंशों से जोड़ा है।ई. मालस्पिनी" और परिकल्पना की गई कि इस नमूने में बढ़ी हुई भर्ती दर अन्य रिश्तेदारों (विधियों) की उपस्थिति को इंगित करती है।परिणामस्वरूप, हमें 10 एमएजी मिले, जो 19 एमएजी का एक संयोजन है जो एक नए परिभाषित परिवार (यानी "सीए. यूडोर्माइक्रोबियासी") के भीतर तीन प्रजातियों में पांच प्रजातियों का प्रतिनिधित्व करता है।मैन्युअल निरीक्षण और गुणवत्ता नियंत्रण (विस्तारित डेटा, चित्र 6 और अतिरिक्त जानकारी) के बाद, हमने पाया कि "Ca.यूडोरमाइक्रोबिएसी प्रजातियां अन्य "सीए" सदस्यों की तुलना में बड़े जीनोम (8 एमबी) और समृद्ध जैवसंश्लेषक क्षमता (प्रति प्रजाति 14 से 22 बीजीसी) प्रस्तुत करती हैं।क्लैड एरेमीओबैक्टीरोटा (7 बीजीसी तक) (चित्र 3ए-सी)।
ए, पांच 'सीए' की फाइलोजेनेटिक स्थिति।यूडोरमाइक्रोबियासी की प्रजातियों ने इस अध्ययन में पहचानी गई समुद्री रेखाओं के लिए विशिष्ट बीजीसी समृद्धि दिखाई।फ़ाइलोजेनेटिक वृक्ष में सभी 'Ca' शामिल हैं।जीटीडीबी (संस्करण 89) में प्रदान किए गए एमएजी एरेमीओबैक्टीरोटा और अन्य फ़ाइला (कोष्ठक में जीनोम संख्या) के सदस्यों का उपयोग विकासवादी पृष्ठभूमि (विधियों) के लिए किया गया था।सबसे बाहरी परतें पारिवारिक स्तर पर वर्गीकरण का प्रतिनिधित्व करती हैं (“Ca. यूडोर्माइक्रोबियासी” और “Ca. ज़ेनोबियासी”) और वर्ग स्तर पर (“Ca. एरेमीओबैक्टीरिया”)।इस अध्ययन में वर्णित पांच प्रजातियों को अल्फ़ान्यूमेरिक कोड और प्रस्तावित द्विपद नामों (पूरक सूचना) द्वारा दर्शाया गया है।बी, ठीक है.यूडोरमाइक्रोबिएसी प्रजातियां सात सामान्य बीजीसी नाभिक साझा करती हैं।A2 क्लैड में BGC की अनुपस्थिति प्रतिनिधि MAG (पूरक तालिका 3) की अपूर्णता के कारण थी।बीजीसी "सीए" के लिए विशिष्ट हैं।एम्फिथोमिक्रोबियम" और "सीए.एम्फिथोमिक्रोबियम” (क्लैड ए और बी) नहीं दिखाए गए हैं।सी, सभी बीजीसी को "सीए" के रूप में एन्कोड किया गया है।यूडोरेमाइक्रोबियम टारोसेनी को तारा के महासागरों से लिए गए 623 मेटाट्रांसक्रिपटोम्स में व्यक्त किया गया था।ठोस वृत्त सक्रिय प्रतिलेखन को दर्शाते हैं।नारंगी वृत्त हाउसकीपिंग जीन अभिव्यक्ति दर (विधियों) के नीचे और ऊपर लॉग2-रूपांतरित गुना परिवर्तनों को दर्शाते हैं।डी, सापेक्ष बहुतायत वक्र (तरीके) 'सीए' दिखा रहे हैं।यूडोरमाइक्रोबिएसी की प्रजातियाँ अधिकांश समुद्री घाटियों और संपूर्ण जल स्तंभ (सतह से कम से कम 4000 मीटर की गहराई तक) में व्यापक हैं।इन अनुमानों के आधार पर, हमने पाया कि 'सीए.गहरे समुद्र में पेलजिक अनाज से जुड़े समुदायों में प्रोकैरियोटिक कोशिकाओं में ई. मैलास्पिनि की हिस्सेदारी 6% तक है।हम एक प्रजाति को किसी साइट पर मौजूद मानते हैं यदि वह किसी दी गई गहराई परत के आकार के किसी भी अंश में पाई जाती है।आईओ - हिंद महासागर, एनएओ - उत्तरी अटलांटिक, एनपीओ - ​​उत्तरी प्रशांत, आरएस - लाल सागर, एसएओ - दक्षिण अटलांटिक, एसओ - दक्षिणी महासागर, एसपीओ - ​​दक्षिण प्रशांत।
Ca की प्रचुरता और वितरण का अध्ययन।यूडोरमाइक्रोबिएसी, जैसा कि हमने पाया, अधिकांश समुद्री घाटियों के साथ-साथ पूरे जल स्तंभ में प्रबल होता है (चित्र 3डी)।स्थानीय रूप से, वे समुद्री माइक्रोबियल समुदाय का 6% हिस्सा बनाते हैं, जो उन्हें वैश्विक समुद्री माइक्रोबायोम का एक महत्वपूर्ण हिस्सा बनाता है।इसके अलावा, हमें Ca की सापेक्ष सामग्री मिली।यूडोरमाइक्रोबिएसी प्रजातियां और उनके बीजीसी अभिव्यक्ति का स्तर यूकेरियोटिक समृद्ध अंश (चित्र 3 सी और विस्तारित डेटा, चित्र 7) में उच्चतम था, जो प्लवक सहित कण पदार्थ के साथ संभावित बातचीत का संकेत देता है।यह अवलोकन 'सीए' से कुछ समानता रखता है।यूडोरेमाइक्रोबियम बीजीसी जो ज्ञात मार्गों के माध्यम से साइटोटोक्सिक प्राकृतिक उत्पादों का उत्पादन करते हैं, अन्य शिकारियों के समान शिकारी व्यवहार (पूरक सूचना और विस्तारित डेटा, चित्र 8) प्रदर्शित कर सकते हैं जो विशेष रूप से मायक्सोकोकस41 जैसे मेटाबोलाइट्स का उत्पादन करते हैं।सीए की खोजप्रोकैरियोटिक नमूनों के बजाय कम उपलब्ध (गहरे समुद्र) या यूकेरियोटिक में यूडोर्माइक्रोबियासी यह बता सकता है कि ये बैक्टीरिया और उनकी अप्रत्याशित बीजीसी विविधता प्राकृतिक खाद्य अनुसंधान के संदर्भ में अस्पष्ट क्यों रहती है।
अंततः, हमने नए रास्तों, एंजाइमों और प्राकृतिक उत्पादों की खोज में अपने माइक्रोबायोम-आधारित काम के वादे को प्रयोगात्मक रूप से मान्य करने की कोशिश की।बीजीसी के विभिन्न वर्गों के बीच, आरआईपीपी मार्ग परिपक्व एंजाइमों द्वारा कोर पेप्टाइड के विभिन्न पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों के कारण एक समृद्ध रासायनिक और कार्यात्मक विविधता को एनकोड करने के लिए जाना जाता है।इसलिए हमने दो 'सीए' चुने।यूडोरेमाइक्रोबियम' आरआईपीपी बीजीसी (आंकड़े 3बी और 4ए-ई) किसी भी ज्ञात बीजीसी (\(\bar{d}\)MIBiG और \(\bar{d}\)RefSeq 0.2 से ऊपर) के समान ही आधारित हैं।
a-c, गहरे समुद्र में Ca प्रजातियों के लिए विशिष्ट RiPP जैवसंश्लेषण के एक नए (\(\bar{d}\)RefSeq = 0.29) क्लस्टर के इन विट्रो विषम अभिव्यक्ति और इन विट्रो एंजाइमेटिक परख।ई. मैलास्पिनि' से डाइफॉस्फोराइलेटेड उत्पादों का उत्पादन हुआ।सी, उच्च-रिज़ॉल्यूशन (एचआर) एमएस/एमएस (रासायनिक संरचना में बी और वाई आयनों द्वारा दर्शाया गया विखंडन) और एनएमआर (विस्तारित डेटा, चित्र 9) का उपयोग करके पहचाने गए संशोधन।डी, यह फॉस्फोराइलेटेड पेप्टाइड स्तनधारी न्यूट्रोफिल इलास्टेज के कम माइक्रोमोलर निषेध को प्रदर्शित करता है, जो नियंत्रण पेप्टाइड और डीहाइड्रेटिंग पेप्टाइड (रासायनिक निष्कासन प्रेरित निर्जलीकरण) में नहीं पाया जाता है।प्रयोग इसी तरह के परिणाम के साथ तीन बार दोहराया गया था।उदाहरण के लिए, प्रोटीन जैवसंश्लेषण के दूसरे उपन्यास \(\bar{d}\)RefSeq = 0.33) क्लस्टर की विषम अभिव्यक्ति चार परिपक्व एंजाइमों के कार्य को स्पष्ट करती है जो 46 अमीनो एसिड कोर पेप्टाइड को संशोधित करते हैं।एचआर-एमएस/एमएस, आइसोटोप लेबलिंग और एनएमआर विश्लेषण (पूरक सूचना) द्वारा अनुमानित संशोधन की साइट के अनुसार अवशेषों को दाग दिया जाता है।धराशायी रंगाई इंगित करती है कि संशोधन दोनों अवशेषों में से किसी एक पर होता है।यह चित्र एक ही नाभिक पर सभी परिपक्व एंजाइमों की गतिविधि को दिखाने के लिए कई विषम संरचनाओं का संकलन है।एच, एन-मिथाइलेशन के बीच बैकबोन के लिए एनएमआर डेटा का चित्रण।पूर्ण परिणाम चित्र में दिखाए गए हैं।विस्तारित डेटा के साथ 10.i, MIBiG 2.0 डेटाबेस में पाए गए सभी FkbM डोमेन के बीच परिपक्व FkbM प्रोटीन क्लस्टर एंजाइम की फाइलोजेनेटिक स्थिति एन-मिथाइलट्रांसफेरेज़ गतिविधि (पूरक सूचना) के साथ इस परिवार के एक एंजाइम को प्रकट करती है।बीजीसी (ए, ई), पूर्ववर्ती पेप्टाइड संरचनाएं (बी, एफ), और प्राकृतिक उत्पादों की अनुमानित रासायनिक संरचनाओं (सी, जी) के योजनाबद्ध आरेख दिखाए गए हैं।
पहला RiPP मार्ग (\(\bar{d}\)MIBiG = 0.41, \(\bar{d}\)RefSeq = 0.29) केवल गहरे समुद्र की प्रजातियों "Ca" में पाया गया था।ई. मैलास्पिनि” और पेप्टाइड-पूर्ववर्ती के लिए कोड (चित्र 4ए, बी)।इस परिपक्व एंजाइम में, हमने लैंटीपेप्टाइड सिंथेज़ के निर्जलीकरण डोमेन के समरूप एक एकल कार्यात्मक डोमेन की पहचान की है जो सामान्य रूप से फॉस्फोराइलेशन और बाद में 43 को हटाने को उत्प्रेरित करता है (पूरक सूचना)।इसलिए, हम अनुमान लगाते हैं कि पूर्ववर्ती पेप्टाइड के संशोधन में ऐसे दो-चरणीय निर्जलीकरण शामिल है।हालाँकि, टेंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस/एमएस) और परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी (एनएमआर) का उपयोग करके, हमने एक पॉलीफॉस्फोराइलेटेड रैखिक पेप्टाइड (छवि 4 सी) की पहचान की।हालांकि अप्रत्याशित, हमें इसके अंतिम उत्पाद होने का समर्थन करने के लिए साक्ष्य की कई पंक्तियाँ मिलीं: दो अलग-अलग विषम मेजबान और इन विट्रो परीक्षणों में कोई निर्जलीकरण नहीं, परिपक्व एंजाइम के उत्प्रेरक निर्जलीकरण स्थल में उत्परिवर्तित प्रमुख अवशेषों की पहचान।सभी का पुनर्निर्माण "Ca" द्वारा किया गया।ई. मैलास्पिनि जीनोम (विस्तारित डेटा, चित्र 9 और अतिरिक्त जानकारी) और अंत में, फॉस्फोराइलेटेड उत्पाद की जैविक गतिविधि, लेकिन रासायनिक रूप से संश्लेषित निर्जलित रूप नहीं (चित्र 4डी)।वास्तव में, हमने पाया कि यह न्यूट्रोफिल इलास्टेज के खिलाफ कम माइक्रोमोलर प्रोटीज निरोधात्मक गतिविधि प्रदर्शित करता है, जो एकाग्रता रेंज (IC50 = 14.3 μM) 44 में अन्य संबंधित प्राकृतिक उत्पादों की तुलना में है, इस तथ्य के बावजूद कि पारिस्थितिक भूमिका को स्पष्ट किया जाना बाकी है।इन परिणामों के आधार पर, हम मार्ग का नाम "फॉस्फेप्टिन" रखने का प्रस्ताव करते हैं।
दूसरा मामला 'सीए' के ​​लिए विशिष्ट एक जटिल RiPP मार्ग है।जीनस यूडोरेमिक्रोबियम (\(\bar{d}\)MIBiG = 0.46, \(\bar{d}\)RefSeq = 0.33) की भविष्यवाणी प्राकृतिक प्रोटीन उत्पादों को एन्कोड करने के लिए की गई थी (चित्र 4e)।ये रास्ते अपेक्षाकृत कम बीजीसी45 द्वारा एन्कोड किए गए एंजाइमों द्वारा स्थापित अपेक्षित घनत्व और असामान्य रासायनिक संशोधनों की विविधता के कारण विशेष जैव-तकनीकी रुचि के हैं।हमने पाया कि यह प्रोटीन पहले से पहचाने जाने वाले प्रोटीन से अलग है क्योंकि इसमें पॉलीसेरामाइड्स के मुख्य NX5N मोटिफ और लैंडोर्नैमाइड्स 46 के लैंथिओनिन लूप दोनों का अभाव है।सामान्य विषम अभिव्यक्ति पैटर्न की सीमाओं को दूर करने के लिए, हमने चार परिपक्व मार्ग एंजाइमों (विधियों) को चिह्नित करने के लिए एक कस्टम माइक्रोविरगुला एयरोडेनिट्रिफिकन्स सिस्टम के साथ उनका उपयोग किया।एमएस/एमएस, आइसोटोप लेबलिंग और एनएमआर के संयोजन का उपयोग करके, हमने पेप्टाइड के 46-एमिनो एसिड कोर में इन परिपक्व एंजाइमों का पता लगाया (चित्र 4एफ, जी, विस्तारित डेटा, चित्र 10-12 और अतिरिक्त जानकारी)।परिपक्व एंजाइमों के बीच, हमने RiPP मार्ग में FkbM O-मिथाइलट्रांसफेरेज़ परिवार के सदस्य 47 की पहली उपस्थिति की विशेषता बताई और अप्रत्याशित रूप से पाया कि यह परिपक्व एंजाइम बैकबोन एन-मिथाइलेशन (छवि 4h, i और अतिरिक्त जानकारी) का परिचय देता है।यद्यपि यह संशोधन प्राकृतिक एनआरपी48 उत्पादों में जाना जाता है, एमाइड बांड का एंजाइमेटिक एन-मिथाइलेशन एक जटिल लेकिन जैव-तकनीकी रूप से महत्वपूर्ण प्रतिक्रिया49 है जो अब तक बोरोसिन के आरआईपीपी परिवार के लिए रुचिकर रहा है।विशिष्टता 50,51.एंजाइमों और आरआईपीपी के अन्य परिवारों में इस गतिविधि की पहचान से नए अनुप्रयोग खुल सकते हैं और प्रोटीन 52 की कार्यात्मक विविधता और उनकी रासायनिक विविधता का विस्तार हो सकता है।पहचाने गए संशोधनों और प्रस्तावित उत्पाद संरचना की असामान्य लंबाई के आधार पर, हम एक मार्ग नाम "पाइथोनामाइड" प्रस्तावित करते हैं।
एंजाइमों के एक कार्यात्मक रूप से चित्रित परिवार में एक अप्रत्याशित एंजाइमोलॉजी की खोज नई खोजों के लिए पर्यावरणीय जीनोमिक्स के वादे को दर्शाती है, और अकेले अनुक्रम होमोलॉजी के आधार पर कार्यात्मक अनुमान के लिए सीमित क्षमता को भी दर्शाती है।इस प्रकार, गैर-विहित बायोएक्टिव पॉलीफॉस्फोराइलेटेड आरआईपीपी की रिपोर्ट के साथ, हमारे परिणाम जैव रासायनिक यौगिकों की कार्यात्मक समृद्धि, विविधता और असामान्य संरचनाओं को पूरी तरह से उजागर करने के लिए सिंथेटिक जीवविज्ञान प्रयासों के लिए संसाधन-गहन लेकिन महत्वपूर्ण मूल्य प्रदर्शित करते हैं।
यहां हम वैश्विक समुद्री माइक्रोबायोम में रोगाणुओं और उनके जीनोमिक संदर्भ द्वारा एन्कोड की गई जैवसंश्लेषक क्षमता की सीमा को प्रदर्शित करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप वैज्ञानिक समुदाय को संसाधन उपलब्ध कराकर भविष्य के अनुसंधान की सुविधा मिलती है (https://microbiomics.io/ocean/)।हमने पाया कि इसकी अधिकांश फ़ाइलोजेनेटिक और कार्यात्मक नवीनता केवल एमएजी और एसएजी के पुनर्निर्माण से प्राप्त की जा सकती है, विशेष रूप से कम उपयोग किए गए माइक्रोबियल समुदायों में जो भविष्य के बायोप्रोस्पेक्टिंग प्रयासों का मार्गदर्शन कर सकते हैं।हालाँकि हम यहाँ 'सीए' पर ध्यान केन्द्रित करेंगे।यूडोरमाइक्रोबिएसी'' एक वंशावली के रूप में विशेष रूप से जैवसंश्लेषक रूप से ''प्रतिभाशाली'' है, अनदेखे माइक्रोबायोटा में भविष्यवाणी की गई कई बीजीसी संभावित रूप से पहले से वर्णित एंजाइमों को एन्कोड करती हैं जो पर्यावरणीय और/या जैव-तकनीकी रूप से महत्वपूर्ण क्रियाओं के साथ यौगिक उत्पन्न करती हैं।
महासागरीय घाटियों, गहरी परतों और समय के साथ वैश्विक समुद्री माइक्रोबियल समुदायों के कवरेज को अधिकतम करने के लिए पर्याप्त अनुक्रमण गहराई के साथ प्रमुख समुद्र विज्ञान और समय श्रृंखला अध्ययनों से मेटागेनोमिक डेटासेट शामिल किए गए थे।इन डेटासेट (पूरक तालिका 1 और चित्र 1) में तारा के महासागरों में एकत्र किए गए नमूनों से मेटागेनोमिक्स (वायरल समृद्ध, एन = 190; प्रोकैरियोटिक समृद्ध, एन = 180) 12,22 और बायोजियोट्रेस अभियान (एन = 480) शामिल हैं।हवाईयन महासागरीय समय श्रृंखला (HOT, n = 68), बरमूडा-अटलांटिक समय श्रृंखला (BATS, n = 62)21 और मालास्पिना अभियान (n = 58)23।सभी मेटागेनोमिक टुकड़ों से अनुक्रमण रीड्स को गुणवत्ता के लिए BBMap (v.38.71) का उपयोग करके फ़िल्टर किया गया था, रीड्स से अनुक्रमण एडेप्टर को हटाकर, गुणवत्ता नियंत्रण अनुक्रमों (PhiX जीनोम) में मैप किए गए रीड्स को हटाकर, और ट्रिमक्यू = 14, मैक = 20 का उपयोग करके खराब रीड क्वालिटी को हटा दिया गया था। अधिकतम = 0 और न्यूनतम लंबाई = 45। बाद के विश्लेषण चलाए गए या निर्दिष्ट होने पर क्यूसी रीड्स के साथ विलय कर दिए गए (bbmerge.sh minoverlap = 16)।मेटास्पेड्स (v.3.11.1 या v.3.12 यदि आवश्यक हो)53 का उपयोग करके निर्माण से पहले QC रीडिंग को सामान्यीकृत किया गया था (bbnorm.sh लक्ष्य = 40, माइंडडेप्थ = 0)।परिणामी मचान कंटिग्स (बाद में मचान के रूप में संदर्भित) को अंततः लंबाई (≥1 केबी) द्वारा फ़िल्टर किया गया था।
1038 मेटागेनोमिक नमूनों को समूहों में विभाजित किया गया था, और नमूनों के प्रत्येक समूह के लिए, सभी नमूनों की मेटागेनोमिक गुणवत्ता नियंत्रण रीडिंग को प्रत्येक नमूने के कोष्ठक से अलग-अलग मिलान किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप जोड़ीदार ब्रैकेटेड समूह की संख्या निम्नलिखित थी: तारा समुद्री वायरस - समृद्ध (190×190), प्रोकैरियोट्स एनरिच्ड (180×180), बायोजियोट्रेसेस, हॉट और बैट्स (610×610) और मैलास्पिना (58×58)।मैपिंग बरोज़-व्हीलर-एलाइनर (बीडब्ल्यूए) (v.0.7.17-r1188)54 का उपयोग करके की गई थी जो रीडिंग को द्वितीयक साइटों से मिलान करने की अनुमति देती है (-ए ध्वज का उपयोग करके)।संरेखण को कम से कम 45 आधार लंबा, ≥97% पहचान और ≥80% पढ़ने के लिए फ़िल्टर किया गया था।परिणामी BAM फ़ाइलों को प्रत्येक समूह के लिए इंट्रा- और इंटर-सैंपल कवरेज प्रदान करने के लिए MetaBAT2 (v.2.12.1)55 के लिए jgi_summarize_bam_contig_depths स्क्रिप्ट का उपयोग करके संसाधित किया गया था।अंत में, -minContig 2000 और -maxEdges 500 के साथ सभी नमूनों पर व्यक्तिगत रूप से MetaBAT2 चलाकर संवेदनशीलता बढ़ाने के लिए ब्रैकेट को समूहीकृत किया गया। हम एक एन्सेम्बल बॉक्सर के बजाय MetaBAT2 का उपयोग करते हैं क्योंकि इसे स्वतंत्र परीक्षणों में सबसे प्रभावी एकल बॉक्सर के रूप में दिखाया गया है।और आमतौर पर इस्तेमाल होने वाले अन्य मुक्केबाजों की तुलना में 10 से 50 गुना तेज।57।बहुतायत सहसंबंधों के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए, मेटागेनोमिक्स के एक यादृच्छिक रूप से चयनित उपनमूना (दो तारा महासागर डेटासेट में से प्रत्येक के लिए 10, बायोजियोट्रेसेस के लिए 10, प्रत्येक समय श्रृंखला के लिए 5, और मालास्पिना के लिए 5) ने अतिरिक्त रूप से केवल नमूनों का उपयोग किया।कवरेज जानकारी प्राप्त करने के लिए आंतरिक नमूनों को समूहीकृत किया जाता है।(अतिरिक्त जानकारी)।
अतिरिक्त (बाहरी) जीनोम को बाद के विश्लेषण में शामिल किया गया था, अर्थात् तारा ओसियंस26 डेटासेट के सबसेट से 830 मैन्युअल रूप से चयनित एमएजी, जीओआरजी20 डेटासेट से 5287 एसएजी, और 1707 पृथक आरईएफ से एमएआर डेटाबेस (मारडीबी बनाम 4) से डेटा और 682 एसएजी) 27. MarDB डेटासेट के लिए, जीनोम का चयन उपलब्ध मेटाडेटा के आधार पर किया जाता है यदि नमूना प्रकार निम्नलिखित नियमित अभिव्यक्ति से मेल खाता है: '[S|s]ingle.?[C|c]ell|[C|c]ulture| [मैं|i] पृथक'।
प्रत्येक मेटागेनोमिक कंटेनर और बाहरी जीनोम की गुणवत्ता का मूल्यांकन चेकएम (v.1.0.13) और अन्वियो के वंश वर्कफ़्लो (v.5.5.0)58,59 का उपयोग करके किया गया था।यदि चेकएम या अनविओ ≥50% पूर्णता/संपूर्णता और ≤10% संदूषण/अतिरेक की रिपोर्ट करता है, तो बाद के विश्लेषण के लिए मेटागेनोमिक कोशिकाओं और बाहरी जीनोम को बचाएं।इन अंकों को सामुदायिक मानदंड 60 के अनुसार जीनोम गुणवत्ता को वर्गीकृत करने के लिए औसत पूर्णता (एमसीपीएल) और औसत संदूषण (एमसीटीएन) में जोड़ा गया था: उच्च गुणवत्ता: एमसीपीएल ≥ 90% और एमसीटीएन ≤ 5%;अच्छी गुणवत्ता: एमसीपीएल ≥ 70%, एमसीटीएन ≤ 10%, मध्यम गुणवत्ता: एमसीपीएल ≥ 50% और एमसीटीएन ≤ 10%, उचित गुणवत्ता: एमसीपीएल ≤ 90% या एमसीटीएन ≥ 10%।फ़िल्टर किए गए जीनोम को गुणवत्ता स्कोर (क्यू और क्यू') के साथ निम्नानुसार सहसंबद्ध किया गया: क्यू = एमसीपीएल - 5 एक्स एमसीटीएन क्यू' = एमसीपीएल - 5 एक्स एमसीटीएन + एमसीटीएन एक्स (तनाव परिवर्तनशीलता)/100 + 0.5 एक्स लॉग [एन50]।(dRep61 में कार्यान्वित)।
विभिन्न डेटा स्रोतों और जीनोम प्रकारों (एमएजी, एसएजी और आरईएफ) के बीच तुलनात्मक विश्लेषण की अनुमति देने के लिए, डीआरईपी (v.2.5.4) का उपयोग करके जीनोम-वाइड औसत न्यूक्लियोटाइड पहचान (एएनआई) के आधार पर 34,799 जीनोम को डीरेफ़रेंस किया गया था।दोहराव)61 ​​95% एएनआई थ्रेशोल्ड28,62 (-कॉम्प 0 -कॉन 1000 -एसए 0.95 -एनसी 0.2) और सिंगल-कॉपी मार्कर जीन के साथ SpecI63 का उपयोग करके प्रजाति स्तर पर जीनोम क्लस्टरिंग प्रदान करता है।ऊपर परिभाषित अधिकतम गुणवत्ता स्कोर (क्यू') के अनुसार प्रत्येक डीआरईपी क्लस्टर के लिए एक प्रतिनिधि जीनोम का चयन किया गया था, जिसे प्रजातियों का प्रतिनिधि माना जाता था।
मैपिंग गति का मूल्यांकन करने के लिए, BWA (v.0.7.17-r1188, -a) का उपयोग ओएमडी में निहित 34,799 जीनोम के साथ मेटागेनोमिक रीड्स के सभी 1038 सेटों को मैप करने के लिए किया गया था।गुणवत्ता-नियंत्रित रीड्स को सिंगल-एंडेड मोड में मैप किया गया था और परिणामी संरेखण को केवल संरेखण ≥45 बीपी लंबाई में बनाए रखने के लिए फ़िल्टर किया गया था।और पहचान ≥95%.प्रत्येक नमूने के लिए प्रदर्शन अनुपात निस्पंदन के बाद शेष रीडिंग के प्रतिशत को गुणवत्ता नियंत्रण रीडिंग की कुल संख्या से विभाजित किया जाता है।उसी दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, 1038 मेटागेनोम में से प्रत्येक को 5 मिलियन आवेषण (विस्तारित डेटा, चित्र 1 सी) तक कम कर दिया गया और ओएमडी और सभी जीईएम16 में जीओआरजी एसएजी से मिलान किया गया।GEM16 कैटलॉग में समुद्री जल से बरामद एमएजी की मात्रा मेटागेनोमिक स्रोतों के कीवर्ड क्वेरीज़ द्वारा निर्धारित की गई थी, समुद्री जल के नमूनों का चयन (उदाहरण के लिए, समुद्री तलछट के विपरीत)।विशेष रूप से, हम "जलीय" को "पारिस्थितिकी तंत्र_श्रेणी", "समुद्री" को "पारिस्थितिकी तंत्र_प्रकार" के रूप में चुनते हैं, और "निवास स्थान" को "गहरा महासागर", "समुद्री", "समुद्री समुद्री", "पेलजिक समुद्री", "समुद्री जल" के रूप में फ़िल्टर करते हैं। "महासागर", "समुद्री जल", "सतही समुद्री जल", "सतही समुद्री जल"।इसके परिणामस्वरूप 1823 ओटीयू में 5903 एमएजी (734 उच्च गुणवत्ता) वितरित किए गए (यहां देखें)।
प्रोकैरियोटिक जीनोम को जीटीडीबी-टीके (v.1.0.2)64 का उपयोग करके जीटीडीबी आर89 संस्करण 13 को लक्षित करने वाले डिफ़ॉल्ट मापदंडों के साथ टैक्सोनॉमिक रूप से एनोटेट किया गया था। एन्विओ का उपयोग डोमेन भविष्यवाणी और रिकॉल ≥50% और अतिरेक ≤ 10% के आधार पर यूकेरियोटिक जीनोम की पहचान करने के लिए किया गया था।किसी प्रजाति के वर्गीकरण एनोटेशन को उसके प्रतिनिधि जीनोम में से एक के रूप में परिभाषित किया गया है।यूकेरियोट्स (148 एमएजी) के अपवाद के साथ, प्रत्येक जीनोम को पहले प्रोक्का (v.1.14.5)65 का उपयोग करके कार्यात्मक रूप से एनोटेट किया गया था, संपूर्ण जीन का नामकरण किया गया था, आवश्यकतानुसार "आर्किया" या "बैक्टीरिया" मापदंडों को परिभाषित किया गया था, जो गैर-के लिए भी रिपोर्ट किया गया है। कोडिंग जीन.और सीआरआईएसपीआर क्षेत्र, अन्य जीनोमिक विशेषताओं के बीच।FetchMG (v.1.2)66 का उपयोग करके यूनिवर्सल सिंगल-कॉपी मार्कर जीन (uscMG) की पहचान करके अनुमानित जीन को एनोटेट करें, एगएनओजी (v.5.0)68 के आधार पर इमैपर (v.2.0.1)67 का उपयोग करके ऑर्थोलॉग समूह और क्वेरी असाइन करें।KEGG डेटाबेस (10 फरवरी, 2020 को प्रकाशित) 69. अंतिम चरण ≥70% की क्वेरी और विषय कवरेज के साथ DIAMOND (v.0.9.30)70 का उपयोग करके KEGG डेटाबेस में प्रोटीन का मिलान करके किया गया था।परिणामों को एनसीबीआई प्रोकैरियोटिक जीनोम एनोटेशन पाइपलाइन71 के अनुसार अधिकतम अपेक्षित बिटरेट (लिंक स्वयं) के बिटरेट ≥ 50% के आधार पर फ़िल्टर किया गया था।डिफ़ॉल्ट मापदंडों और विभिन्न क्लस्टर विस्फोटों के साथ एंटीएसएमएएसएच (v.5.1.0)72 का उपयोग करके जीनोम में बीजीसी की पहचान करने के लिए जीन अनुक्रमों का उपयोग इनपुट के रूप में भी किया गया था।सभी जीनोम और एनोटेशन को वेब पर उपलब्ध प्रासंगिक मेटाडेटा (https://microbiomics.io/ocean/) के साथ ओएमडी में संकलित किया गया है।
पहले वर्णित विधियों12,22 के समान हमने ओएमडी से 95% पहचान और छोटे जीन (90% कवरेज)73 तक बैक्टीरिया और आर्कियल जीनोम से 56.6 मिलियन प्रोटीन-कोडिंग जीन को क्लस्टर करने के लिए सीडी-एचआईटी (v.4.8.1) का उपयोग किया। >17.7 मिलियन जीन क्लस्टर।प्रत्येक जीन क्लस्टर के लिए सबसे लंबे अनुक्रम को प्रतिनिधि जीन के रूप में चुना गया था।फिर 1038 मेटागेनोम का मिलान 17.7 मिलियन BWA (-a) क्लस्टर सदस्यों से किया गया और परिणामी BAM फ़ाइलों को केवल ≥95% प्रतिशत पहचान और ≥45 आधार संरेखण के साथ संरेखण बनाए रखने के लिए फ़िल्टर किया गया।लंबाई-सामान्यीकृत जीन प्रचुरता की गणना सबसे पहले सर्वोत्तम अद्वितीय संरेखण से आवेषणों की गणना करके की गई थी और फिर, फ़ज़ी-मैप किए गए आवेषणों के लिए, उनके अद्वितीय आवेषणों की संख्या के आनुपातिक रूप से संबंधित लक्ष्य जीनों में आंशिक गणना जोड़कर की गई थी।
विस्तारित एमओटीयू संदर्भ डेटाबेस बनाने के लिए विस्तारित ओएमडी ("सीए. यूडोर्माइक्रोबियासी" से अतिरिक्त एमएजी के साथ, नीचे देखें) से जीनोम को एमओटीयू74 मेटागेनोमिक विश्लेषण टूल डेटाबेस (v.2.5.1) में जोड़ा गया था।दस यूएससीएमजी में से केवल छह एकल-प्रतिलिपि जीनोम (23,528 जीनोम) बच गए।डेटाबेस के विस्तार के परिणामस्वरूप प्रजाति स्तर पर 4,494 अतिरिक्त क्लस्टर बन गए।डिफ़ॉल्ट एमओटीयू पैरामीटर (v.2) का उपयोग करके 1038 मेटागेनोम का विश्लेषण किया गया।644 एमओटीयू समूहों (95% आरईएफ, 5% एसएजी और 99.9% मारडीबी से संबंधित) में निहित कुल 989 जीनोम का एमओटीयू प्रोफ़ाइल द्वारा पता नहीं लगाया गया था।यह MarDB जीनोम के समुद्री अलगाव के विभिन्न अतिरिक्त स्रोतों को दर्शाता है (अधिकांश अज्ञात जीनोम तलछट, समुद्री मेजबान आदि से पृथक जीवों से जुड़े हैं)।इस अध्ययन में खुले समुद्र के वातावरण पर ध्यान केंद्रित करना जारी रखने के लिए, हमने उन्हें डाउनस्ट्रीम विश्लेषण से बाहर रखा, जब तक कि उनका पता नहीं लगाया गया या इस अध्ययन में बनाए गए विस्तारित एमओटीयू डेटाबेस में शामिल नहीं किया गया।
ओएमडी (ऊपर देखें) में एमएजी, एसएजी और आरईएफ से सभी बीजीसी को सभी मेटागेनोमिक स्कैफोल्ड (एंटीएसएमएएसएच वी.5.0, डिफ़ॉल्ट पैरामीटर) में पहचाने गए बीजीसी के साथ जोड़ा गया था और बीआईजी-एसएलआईसीई (वी.1.1) (पीएफएएम डोमेन)75 का उपयोग करके चित्रित किया गया था।इन विशेषताओं के आधार पर, हमने बीजीसी के बीच सभी कोसाइन दूरियों की गणना की और उन्हें (माध्य लिंक) क्रमशः 0.2 और 0.8 की दूरी सीमा का उपयोग करके जीसीएफ और जीसीसी में समूहीकृत किया।ये थ्रेशोल्ड कोसाइन दूरी के साथ यूक्लिडियन दूरी75 का उपयोग करके पहले उपयोग की जाने वाली थ्रेसहोल्ड का एक अनुकूलन है, जो मूल BiG-SLICE क्लस्टरिंग रणनीति (पूरक सूचना) में कुछ त्रुटि को कम करता है।
पहले बताए अनुसार विखंडन के जोखिम को कम करने के लिए और 1038 मेटागेनोम में नहीं पाए जाने वाले MarDB REF और SAG को बाहर करने के लिए बीजीसी को मचान पर केवल ≥5 केबी एन्कोडेड बनाए रखने के लिए फ़िल्टर किया गया था (ऊपर देखें)।इसके परिणामस्वरूप कुल 39,055 बीजीसी को ओएमडी जीनोम द्वारा एन्कोड किया गया, अतिरिक्त 14,106 को मेटागेनोमिक टुकड़ों पर पहचाना गया (यानी एमएजी में संयुक्त नहीं)।इन "मेटागेनोमिक" बीजीसी का उपयोग डेटाबेस में दर्ज नहीं किए गए समुद्री माइक्रोबायोम जैवसंश्लेषण क्षमता के अनुपात का अनुमान लगाने के लिए किया गया था (पूरक सूचना)।प्रत्येक BGC को BiG-SCAPE76 में परिभाषित एंटी-SMASH या मोटे उत्पाद श्रेणियों द्वारा परिभाषित पूर्वानुमानित उत्पाद प्रकारों के अनुसार कार्यात्मक रूप से चित्रित किया गया था।मात्रा निर्धारण में नमूनाकरण पूर्वाग्रह को रोकने के लिए (जीसीसी/जीसीएफ की वर्गीकरण और कार्यात्मक संरचना, संदर्भ डेटाबेस के लिए जीसीएफ और जीसीसी की दूरी, और जीसीएफ की मेटागोनोमिक प्रचुरता), प्रत्येक प्रजाति के लिए केवल सबसे लंबे बीजीसी प्रति जीसीएफ को ध्यान में रखते हुए, 39,055 बीजीसी को और भी कम कर दिया गया। जिसके परिणामस्वरूप कुल 17,689 बीजीसी प्राप्त हुए।
जीसीसी और जीसीएफ की नवीनता का आकलन गणना किए गए डेटाबेस (बीआईजी-एफएएम में रेफसेक डेटाबेस)29 और प्रयोगात्मक रूप से सत्यापित (एमआईबीआईजी 2.0)30 बीजीसी के बीच की दूरी के आधार पर किया गया था।17,689 प्रतिनिधि बीजीसी में से प्रत्येक के लिए, हमने संबंधित डेटाबेस के लिए सबसे छोटी कोसाइन दूरी को चुना।इन न्यूनतम दूरियों को जीसीएफ या जीसीसी के अनुसार, जैसा उपयुक्त हो, औसत (माध्य) किया जाता है।एक जीसीएफ को नया माना जाता है यदि डेटाबेस की दूरी 0.2 से अधिक है, जो (औसत) जीसीएफ और संदर्भ के बीच एक आदर्श अलगाव से मेल खाती है।जीसीसी के लिए, हम लिंक के साथ दीर्घकालिक संबंध स्थापित करने के लिए 0.4 चुनते हैं, जो जीसीएफ द्वारा परिभाषित सीमा से दोगुना है।
बीजीसी की मेटागेनोमिक प्रचुरता का अनुमान जीन-स्तरीय प्रोफाइल से उपलब्ध इसके बायोसिंथेटिक जीन (एंटी-एसएमएएसएच द्वारा निर्धारित) की औसत प्रचुरता के रूप में लगाया गया था।प्रत्येक जीसीएफ या जीसीसी की मेटागेनोमिक प्रचुरता की गणना तब प्रतिनिधि बीजीसी (17,689 में से) के योग के रूप में की गई थी।इन बहुतायत मानचित्रों को बाद में प्रति-नमूना एमओटीयू गिनती का उपयोग करके सेलुलर संरचना के लिए सामान्यीकृत किया गया, जो अनुक्रमण प्रयासों (विस्तारित डेटा, छवि 1 डी) के लिए भी जिम्मेदार था।जीसीएफ या जीसीसी की व्यापकता की गणना बहुतायत> 0 वाले नमूनों के प्रतिशत के रूप में की गई थी।
नमूनों के बीच यूक्लिडियन दूरी की गणना सामान्यीकृत जीसीएफ प्रोफ़ाइल से की गई थी।UMAP77 का उपयोग करके इन दूरियों को आकार में कम किया गया और परिणामी एम्बेडिंग का उपयोग HDBSCAN78 का उपयोग करके अप्रकाशित घनत्व-आधारित क्लस्टरिंग के लिए किया गया।HDBSCAN द्वारा उपयोग किए जाने वाले क्लस्टर के लिए इष्टतम न्यूनतम अंक (और इसलिए क्लस्टर की संख्या) क्लस्टर सदस्यता की संचयी संभावना को अधिकतम करके निर्धारित किया जाता है।पहचाने गए समूहों (और विचरण के क्रमिक बहुभिन्नरूपी विश्लेषण (पेर्मनोवा) में पूर्वाग्रह को ध्यान में रखने के लिए इन समूहों का एक यादृच्छिक संतुलित उपनमूना) को पेरमानोवा का उपयोग करके कम न की गई यूक्लिडियन दूरियों के खिलाफ महत्व के लिए परीक्षण किया गया था।नमूनों के औसत जीनोम आकार की गणना एमओटीयू की सापेक्ष प्रचुरता और जीनोम के सदस्यों के अनुमानित जीनोम आकार के आधार पर की गई थी।विशेष रूप से, प्रत्येक एमओटीयू के औसत जीनोम आकार का अनुमान उसके सदस्यों के जीनोम आकार के औसत के रूप में लगाया गया था जो पूर्णता के लिए सही किया गया था (फ़िल्टर करने के बाद) (उदाहरण के लिए, 3 एमबी की लंबाई के साथ 75% पूर्ण जीनोम का समायोजित आकार 4 है) एमबी).अखंडता वाले मध्यम जीनोम के लिए ≥70%।प्रत्येक नमूने के लिए औसत जीनोम आकार की गणना सापेक्ष बहुतायत द्वारा भारित एमओटीयू जीनोम आकार के योग के रूप में की गई थी।
ओएमडी में जीनोम-एनकोडेड बीजीसी का एक फ़िल्टर किया गया सेट बैक्टीरियल और आर्कियल जीटीडीबी पेड़ों में दिखाया गया है (≥5 केबी फ्रेमवर्क में, आरईएफ और एसएजी मार्डीबी को छोड़कर जो 1038 मेटाजेनोम में नहीं पाए गए, ऊपर देखें) और फ़ाइलोजेनेटिक के आधार पर उनकी अनुमानित उत्पाद श्रेणियां जीनोम की स्थिति (ऊपर देखें)।हमने सबसे पहले प्रजातियों के आधार पर डेटा को कम किया, प्रतिनिधि के रूप में उस प्रजाति में सबसे अधिक बीजीसी वाले जीनोम का उपयोग किया।विज़ुअलाइज़ेशन के लिए, प्रतिनिधियों को पेड़ समूहों में विभाजित किया गया था, और फिर से, प्रत्येक कोशिका समूह के लिए, सबसे बड़ी संख्या में बीजीसी वाले जीनोम को एक प्रतिनिधि के रूप में चुना गया था।बीजीसी-समृद्ध प्रजातियों (>15 बीजीसी के साथ कम से कम एक जीनोम) का उन बीजीसी में एन्कोड किए गए उत्पाद प्रकारों के लिए शैनन विविधता सूचकांक की गणना करके आगे विश्लेषण किया गया।यदि सभी अनुमानित उत्पाद प्रकार समान हैं, तो रासायनिक संकर और अन्य जटिल बीजीसी (जैसा कि एंटी-एसएमएएच द्वारा भविष्यवाणी की गई है) को एक ही उत्पाद प्रकार से संबंधित माना जाता है, क्लस्टर में उनके क्रम की परवाह किए बिना (उदाहरण के लिए प्रोटीन-बैक्टीरियोसिन और बैक्टीरियोसिन-प्रोटियोप्रोटीन संलयन) शरीर)।संकर)।
मलास्पिना नमूना MP1648 से शेष डीएनए (6 एनजी होने का अनुमान है), जैविक नमूना SAMN05421555 के अनुरूप है और संक्षिप्त पढ़ने के लिए इलुमिना SRR3962772 मेटागेनोमिक रीड सेट से मेल खाता है, PacBio किट SMRTbell gDNA नमूना प्रवर्धन का उपयोग करने के लिए अल्ट्रा-लो इनपुट के साथ PacBio अनुक्रमण प्रोटोकॉल के अनुसार संसाधित किया गया है। किट (100-980-000) और एसएमआरटीबेल एक्सप्रेस 2.0 टेम्पलेट तैयारी किट (100-938-900)।संक्षेप में, शेष डीएनए को कोवरिस (जी-ट्यूब, 52104) का उपयोग करके काटा, मरम्मत और शुद्ध किया गया (प्रोनेक्स मोती)।शुद्ध किए गए डीएनए को अंतिम शुद्धिकरण चरण (प्रोनेक्स मोती) और सीक्वेल II प्लेटफॉर्म पर अनुक्रमण से पहले लाइब्रेरी की तैयारी, प्रवर्धन, शुद्धि (प्रोनेक्स मोती) और आकार चयन (> 6 केबी, ब्लू पिप्पिन) के अधीन किया जाता है।
पहले दो सीए का पुनर्निर्माण।एमएजी एरेमीओबैक्टीरोटा के लिए, हमने छह अतिरिक्त एएनआई>99% की पहचान की (इन्हें चित्र 3 में शामिल किया गया है), जिन्हें शुरू में संदूषण स्कोर के आधार पर फ़िल्टर किया गया था (बाद में जीन दोहराव के रूप में पहचाना गया, नीचे देखें)।हमें "Ca" लेबल वाली एक ट्रे भी मिली।एरेमीओबैक्टीरोटा'' विभिन्न अध्ययनों से प्राप्त किया गया और डाउनसैंपल के लिए BWA (v.0.7.17) Ref -r1188, - एक ध्वज) का उपयोग करके 633 यूकेरियोटिक समृद्ध (>0.8 µm) नमूनों से मेटागेनोमिक रीड्स के संदर्भ के रूप में हमारे अध्ययन से आठ एमएजी के साथ उनका उपयोग किया गया। मैपिंग (5 मिलियन रीड्स)।संवर्धन-विशिष्ट मानचित्रों (95% संरेखण पहचान और 80% रीड कवरेज द्वारा फ़िल्टर किए गए) के आधार पर, असेंबली के लिए 10 मेटाजेनोम्स (अपेक्षित कवरेज ≥5×) और सामग्री सहसंबंध के लिए अतिरिक्त 49 मेटाजेनोम्स (अपेक्षित कवरेज ≥1×) का चयन किया गया था।उपरोक्त समान मापदंडों का उपयोग करते हुए, इन नमूनों को बिन किया गया और 10 अतिरिक्त 'सीए' जोड़े गए।एमएजी एरेमीओबैक्टेरोटा को बहाल कर दिया गया है।ये 16 एमएजी (डेटाबेस में पहले से मौजूद दो की गिनती नहीं) विस्तारित ओएमडी में जीनोम की कुल संख्या 34,815 तक लाते हैं।एमएजी को उनकी जीनोमिक समानता और जीटीडीबी में स्थिति के आधार पर टैक्सोनोमिक रैंक सौंपी जाती है।18 एमएजी को डीआरईपी का उपयोग करके एक ही परिवार के भीतर 5 प्रजातियों (इंट्रास्पेसिफिक एएनआई>99%) और 3 जेनेरा (इंट्राजेनेरिक एएनआई 85% से 94%) में दोहराया गया था।अखंडता, संदूषण और N50 के आधार पर प्रजातियों के प्रतिनिधियों को मैन्युअल रूप से चुना गया था।सुझाया गया नामकरण अनुपूरक सूचना में प्रदान किया गया है।
'सीए' की अखंडता और संदूषण का आकलन करें।एमएजी एरेमीओबैक्टीरोटा, हमने यूएससीएमजी की उपस्थिति के साथ-साथ चेकएम और अनविओ द्वारा उपयोग किए जाने वाले वंश- और डोमेन-विशिष्ट एकल-कॉपी मार्कर जीन सेट का आकलन किया।40 यूएससीएमजी में से 2 डुप्लिकेट की पहचान की पुष्टि फ़ाइलोजेनेटिक पुनर्निर्माण (नीचे देखें) द्वारा की गई थी ताकि किसी भी संभावित संदूषण को दूर किया जा सके (यह इन 40 मार्कर जीनों के आधार पर 5% से मेल खाता है)।पांच प्रतिनिधि एमएजी 'सीए का एक अतिरिक्त अध्ययन।इन पुनर्निर्मित जीनोम में संदूषकों के निम्न स्तर की पुष्टि प्रचुरता और अनुक्रम संरचना सहसंबंधों (पूरक सूचना)59 के आधार पर इंटरैक्टिव एन्विओ इंटरफ़ेस का उपयोग करके एरेमीओबैक्टीरोटा प्रजातियों के लिए की गई थी।
फाइलोजेनोमिक विश्लेषण के लिए, हमने पांच प्रतिनिधि एमएजी "सीए" का चयन किया।यूडोरमाइक्रोबियासी", सभी प्रजातियाँ" सीए।एरेमीओबैक्टीरिया और अन्य फ़ाइला के सदस्यों (यूबीपी13, आर्मेटिमोनडोटा, पेटेसिबैक्टेरिया, डॉर्मिबैक्टेरोटा, क्लोरोफ्लेक्सोटा, सायनोबैक्टीरिया, एक्टिनोबैक्टीरिया और प्लैंक्टोमाइसेटोटा सहित) का जीनोम जीटीडीबी (आर89)13 से उपलब्ध है।इन सभी जीनोमों को एकल प्रतिलिपि मार्कर जीन निष्कर्षण और बीजीसी एनोटेशन के लिए पहले वर्णित अनुसार एनोटेट किया गया था।जीटीडीबी जीनोम को उपरोक्त अखंडता और संदूषण मानदंडों के अनुसार संरक्षित किया गया था।फ़ाइलोजेनेटिक विश्लेषण Anvi'o फ़ाइलोजेनेटिक्स59 वर्कफ़्लो का उपयोग करके किया गया था।पेड़ का निर्माण IQTREE (v.2.0.3) (डिफ़ॉल्ट विकल्प और -bb 1000)80 का उपयोग करके Anvi'o (MUSCLE, v.3.8.1551)81 द्वारा पहचाने गए 39 अग्रानुक्रम राइबोसोमल प्रोटीन के संरेखण पर किया गया था।उनके पद कम कर दिये गये।जीनोम82 के कम से कम 50% को कवर करने के लिए और जीटीडीबी ट्री टोपोलॉजी के आधार पर प्लैंक्टोमाइसेकोटा को एक आउटग्रुप के रूप में इस्तेमाल किया गया था।40 यूएससीएमजी का एक पेड़ समान उपकरणों और मापदंडों का उपयोग करके बनाया गया था।
हमने सामान्य माइक्रोबियल लक्षणों की भविष्यवाणी करने के लिए डिफ़ॉल्ट मापदंडों (फेनोटाइप, न्यूक्लियोटाइड्स से)83 के साथ ट्रैटार (v.1.1.2) का उपयोग किया।हमने पहले से विकसित शिकारी सूचकांक84 के आधार पर एक संभावित शिकारी जीवन शैली का पता लगाया जो जीनोम में प्रोटीन-कोडिंग जीन की सामग्री पर निर्भर करता है।विशेष रूप से, हम ऑर्थोएमसीएल डेटाबेस (v.4)85 के विरुद्ध जीनोम में प्रोटीन की तुलना करने के लिए -अधिक-संवेदनशील -आईडी 25 -क्वेरी-कवर 70 -विषय-कवर 70 -टॉप 20 विकल्पों का उपयोग करके डायमंड का उपयोग करते हैं और संबंधित जीन की गिनती करते हैं शिकारियों और गैर-शिकारियों के लिए मार्कर जीन।सूचकांक शिकारी और गैर-शिकारी चिह्नों की संख्या के बीच का अंतर है।अतिरिक्त नियंत्रण के रूप में, हमने "Ca" जीनोम का भी विश्लेषण किया।एंटोथीओनेला TSY118 कारक Ca के साथ इसके जुड़ाव पर आधारित है।यूडोरेमाइक्रोबियम (बड़े जीनोम का आकार और जैवसंश्लेषक क्षमता)।इसके बाद, हमने शिकारी और गैर-शिकारी मार्कर जीन और सीए की जैवसंश्लेषक क्षमता के बीच संभावित लिंक का परीक्षण किया।यूडोरमाइक्रोबिएसी" और पाया गया कि एक से अधिक जीन (किसी भी प्रकार के मार्कर जीन से, यानी शिकारी/गैर-शिकारी जीन) बीजीसी के साथ ओवरलैप नहीं होता है, यह सुझाव देता है कि बीजीसी शिकार के संकेतों को भ्रमित नहीं करता है।विशेष रूप से स्राव प्रणाली, पिली और फ्लैगेला86 की जांच करने के लिए TXSSCAN (v.1.0.2) का उपयोग करके तले हुए प्रतिकृतियों का अतिरिक्त जीनोमिक एनोटेशन किया गया था।
तारा महासागरों 22,40,87 (बीडब्ल्यूए, वी.0.7.17-आर1188, -ए ध्वज का उपयोग करके) के प्रोकैरियोटिक और यूकेरियोटिक संवर्धन अंशों से 623 मेटाट्रांसक्रिप्टोम की मैपिंग करके पांच प्रतिनिधि 'सीए' को मैप किया गया था।यूडोरमाइक्रोबियासी जीनोम।BAM फ़ाइलों को 80% रीड कवरेज और 95% पहचान फ़िल्टरिंग के बाद फ़ीचरकाउंट्स (v.2.0.1)88 के साथ संसाधित किया गया था (विकल्प फ़ीचरकाउंट्स -प्राइमरी -ओ -फ्रैक्शन -टी सीडीएस, टीआरएनए -एफ जीटीएफ -जी आईडी -पी के साथ) गिनती करता है प्रति जीन सम्मिलन की संख्या.जेनरेट किए गए मानचित्रों को जीन की लंबाई और मार्कर जीन बहुतायत एमओटीयू (सम्मिलन गिनती> 0 के साथ जीन के लिए लंबाई-सामान्यीकृत औसत प्रविष्टि गिनती) के लिए सामान्यीकृत किया गया था और प्रत्येक जीन स्तर की प्रति कोशिका सापेक्ष अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए 22.74 में लॉग-रूपांतरित किया गया था, जो यह भी बताता है अनुक्रमण के दौरान नमूने से नमूने में परिवर्तनशीलता।ऐसे अनुपात तुलनात्मक विश्लेषण की अनुमति देते हैं, सापेक्ष बहुतायत डेटा का उपयोग करते समय संरचना समस्याओं को कम करते हैं।जीनोम के एक बड़े हिस्से का पता लगाने की अनुमति देने के लिए आगे के विश्लेषण के लिए केवल 10 एमओटीयू मार्कर जीन में से 5 वाले नमूनों पर विचार किया गया।
'सीए' की सामान्यीकृत प्रतिलेख प्रोफ़ाइल।ई. टैरोसेनी को यूएमएपी का उपयोग करके आयामीता में कमी के अधीन किया गया था और परिणामी प्रतिनिधित्व का उपयोग अभिव्यक्ति की स्थिति निर्धारित करने के लिए एचडीबीएससीएएन (ऊपर देखें) का उपयोग करके अप्रकाशित क्लस्टरिंग के लिए किया गया था।पेरमानोवा मूल (कम नहीं) दूरी वाले स्थान में पहचाने गए समूहों के बीच अंतर के महत्व का परीक्षण करता है।इन स्थितियों के बीच विभेदक अभिव्यक्ति का पूरे जीनोम में परीक्षण किया गया (ऊपर देखें) और 6 कार्यात्मक समूहों में 201 केईजीजी मार्गों की पहचान की गई, अर्थात्: बीजीसी, स्राव प्रणाली और टीएक्सएसएससीएएन से फ्लैगेलर जीन, गिरावट एंजाइम (प्रोटीज और पेप्टिडेस), और शिकारी और गैर- शिकारी जीन.शिकारी सूचकांक मार्कर।प्रत्येक नमूने के लिए, हमने प्रत्येक वर्ग के लिए औसत सामान्यीकृत अभिव्यक्ति की गणना की (ध्यान दें कि बीजीसी अभिव्यक्ति की गणना उस बीजीसी के लिए बायोसिंथेटिक जीन की औसत अभिव्यक्ति के रूप में की जाती है) और राज्यों में महत्व के लिए परीक्षण किया गया (एफडीआर के लिए क्रुस्कल-वालिस परीक्षण समायोजित)।
सिंथेटिक जीन जेनस्क्रिप्ट से खरीदे गए और पीसीआर प्राइमर माइक्रोसिंथ से खरीदे गए।डीएनए प्रवर्धन के लिए थर्मो फिशर साइंटिफिक के फ़्यूज़न पोलीमरेज़ का उपयोग किया गया था।डीएनए शुद्धिकरण के लिए न्यूक्लियोस्पिन प्लास्मिड, न्यूक्लियोस्पिन जेल और मैकेरी-नागेल से पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग किया गया था।प्रतिबंध एंजाइम और टी4 डीएनए लिगेज न्यू इंग्लैंड बायोलैब्स से खरीदे गए थे।आइसोप्रोपिल-बीटा-डी-1-थियोगैलेक्टोपाइरानोसाइड (आईपीटीजी) (बायोसिंथ) और 1,4-डाइथियोथेरिटोल (डीटीटी, अप्लीकेम) के अलावा अन्य रसायन सिग्मा-एल्ड्रिच से खरीदे गए थे और बिना अधिक शुद्धिकरण के उपयोग किए गए थे।एंटीबायोटिक्स क्लोरैम्फेनिकॉल (Cm), स्पेक्टिनोमाइसिन डाइहाइड्रोक्लोराइड (Sm), एम्पीसिलीन (Amp), जेंटामाइसिन (Gt), और कार्बेनिसिलिन (Cbn) AppliChem से खरीदे गए थे।बैक्टो ट्रिप्टोन और बैक्टो यीस्ट एक्सट्रैक्ट मीडिया घटक बीडी बायोसाइंसेज से खरीदे गए थे।अनुक्रमण के लिए ट्रिप्सिन को क्रोमेगा से खरीदा गया था।
एंटी-एसएमएएसएच अनुमानित बीजीसी 75.1 से जीन अनुक्रम निकाले गए थे।ई. मालास्पिनी (पूरक जानकारी)।
जीन EmbA (locus, MALA_SAMN05422137_METAG-framework_127-gene_5), embM (locus, MALA_SAMN05422137_METAG-framework_127-gene_4), और embAM (इंटरजीन क्षेत्रों सहित) को E में अभिव्यक्ति के लिए अनुकूलित कोडन के साथ और बिना pUC57 (AmpR) में सिंथेटिक निर्माण के रूप में अनुक्रमित किया गया था। कब।EmbA जीन को BAMHI और हिंदIII क्लीवेज साइटों के साथ pACYCDuet-1(CmR) और pCDFDuet-1(SmR) की पहली मल्टीपल क्लोनिंग साइट (MCS1) में सबक्लोन किया गया था।EmbM और embMopt जीन (कोडन-अनुकूलित) को BAMHI और हिंदIII के साथ MCS1 pCDFDuet-1(SmR) में उपक्लोन किया गया और pCDFDuet-1(SmR) और pRSFDuet-1(KanR) (MCS2) के दूसरे मल्टीपल क्लोनिंग साइट में रखा गया। एनडीईआई/चोआई.EmbAM कैसेट को BAMHI और हिंदIII क्लीवेज साइटों के साथ pCDFDuet1(SmR) में उपक्लोन किया गया था।Orf3/embI जीन (locus, MALA_SAMN05422137_METAG-scaffold_127-gene_3) का निर्माण प्राइमर EmbI_OE_F_NdeI और EmbI_OE_R_XhoI का उपयोग करके ओवरलैप एक्सटेंशन पीसीआर द्वारा किया गया था, जो NdeI/XhoI के साथ पच गया, और समान प्रतिबंध एंजाइमों (पूरक) का उपयोग करके pCDFDuet-1-EmbM (MCS1) में बंध गया। मेज़)।6).निर्माता के प्रोटोकॉल (न्यू इंग्लैंड बायोलैब्स) के अनुसार प्रतिबंध एंजाइम पाचन और बंधाव किया गया था।