310 10*1 मिमी स्टेनलेस स्टील कुंडलित टयूबिंग रासायनिक घटक, स्पाइड्रोइन के एन-टर्मिनल डोमेन अमाइलॉइड फाइब्रिल पर आधारित हाइड्रोजेल बनाते हैं और प्रोटीन स्थिरीकरण के लिए एक मंच प्रदान करते हैं।

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विनिर्देश

310 10*1 मिमी स्टेनलेस स्टील कुंडलित ट्यूबिंग आपूर्तिकर्ता

रासायनिक संरचना

यांत्रिक विशेषताएं

नए बायोमटेरियल के विकास में रीकॉम्बिनेंट स्पाइडर सिल्क प्रोटीन (स्पाइडर सिल्क प्रोटीन) के कई संभावित अनुप्रयोग हैं, लेकिन उनकी मल्टीमॉडल और एकत्रीकरण-प्रवण प्रकृति उन्हें प्राप्त करना मुश्किल और उपयोग में आसान बनाती है।यहां हम रिपोर्ट करते हैं कि पुनः संयोजक लघु स्पिड्रोइन प्रोटीन और, महत्वपूर्ण रूप से, एन-टर्मिनल डोमेन (एनटी) स्वयं 37 डिग्री सेल्सियस पर तेजी से स्व-सहायक और पारदर्शी हाइड्रोजेल बनाते हैं।एनटी और हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन या प्यूरीन न्यूक्लियोसाइड फॉस्फोरिलेज़ से युक्त संलयन प्रोटीन पूरी तरह कार्यात्मक संलयन प्रोटीन बनाते हैं।हाइड्रोजेल।हमारे परिणाम बताते हैं कि पुनः संयोजक एनटी और संलयन प्रोटीन उच्च अभिव्यक्ति उपज प्रदान करते हैं और हाइड्रोजेल को पारदर्शिता, क्रॉसलिंकिंग के बिना जेलेशन और उच्च घनत्व पर सक्रिय प्रोटीन के प्रत्यक्ष स्थिरीकरण जैसे आकर्षक गुणों से संपन्न करते हैं।
मकड़ियों में रेशम ग्रंथियों के सात अलग-अलग सेट होते हैं, जिनमें से प्रत्येक एक विशिष्ट प्रकार का रेशम पैदा करता है।सभी सात रेशम प्रजातियाँ मकड़ी रेशम प्रोटीन (स्पाइडरोइन्स) से बनी हैं जो लगभग 6000 अवशेष लंबे हैं और इसमें गोलाकार एन- और सी-टर्मिनल डोमेन (एनटी और सीटी) 1,2 से घिरा एक बड़ा केंद्रीय दोहराव क्षेत्र होता है।रेशम का सबसे व्यापक रूप से अध्ययन किया जाने वाला प्रकार, प्राथमिक एम्पुला, प्राथमिक एम्पुला ग्रंथि द्वारा निर्मित होता है।इस ग्रंथि में, उपकला कोशिकाओं की एक मोनोलेयर स्पाइड्रोइन प्रोटीन को संश्लेषित करती है और उन्हें ग्रंथि के लुमेन में स्रावित करती है, जहां वे अत्यधिक उच्च सांद्रता (30-50% w/v)3,4 पर घुलनशील रूप (डोपिंग) में मौजूद होते हैं।ग्रंथि में मुख्य एम्पुलर स्पिड्रोइन प्रोटीन के संगठन और संरचना पर बहस हुई है, लेकिन अधिकांश प्रायोगिक साक्ष्य आम तौर पर पेचदार और/या यादृच्छिक पेचदार संरचना और माइक्रेलर या लैमेलर संरचनाओं5,6,7,8,9,10 की उपस्थिति का संकेत देते हैं।जबकि दोहराए जाने वाले डोमेन रेशम फाइबर के यांत्रिक गुणों को नियंत्रित करते हैं, β-शीट नैनोक्रिस्टल और अनाकार संरचनाएं बनाते हैं11,12,13,14,15, अंतिम डोमेन रेशम ग्रंथि के साथ बदलती स्थितियों के जवाब में रेशम फाइबर को विनियमित करते हैं16,17,18।रेशम निर्माण को नियंत्रित करके, 19. टर्मिनल डोमेन को क्रमिक रूप से संरक्षित किया जाता है और उनका कार्य सभी स्पिड्रोइन प्रोटीन 2,20,21 के लिए सामान्य हो सकता है।ग्रंथि से गुजरने के दौरान, स्पाइडरोइन का पीएच लगभग 7.6 से घटकर <5.716 हो जाता है और धीरे-धीरे संकीर्ण नलिका के माध्यम से गति के कारण कतरनी और खिंचाव के साथ बढ़ता है।समाधान में, CT एक α-पेचदार संवैधानिक समानांतर डिमर17 है, लेकिन कम पीएच और कतरनी बलों के जवाब में, CT खुलता है और β-परतों16, 17 को स्विच करता है, संभवतः कन्वर्ट 16 के दोहराव वाले क्षेत्रों में β-परतों को ट्रिगर करता है। NT मोनोमेरिक हैं ग्रंथि के लुमेन में स्थितियों को प्रतिबिंबित करने वाली स्थितियां और स्पिड्रोइन की घुलनशीलता में मध्यस्थता करती हैं, लेकिन कम पीएच पर, कई कार्बोक्जिलिक एसिड साइड चेन के प्रोटोनेशन से लगभग 6.5 के पीकेए के साथ एनटी का डिमराइजेशन होता है, जिससे एनटी स्थिर हो जाता है और बड़े पैमाने पर स्पिड्रोइन को ठीक किया जाता है। मात्राएँ.नेटवर्क16,18.इस प्रकार, एनटी फिलामेंट निर्माण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, कोटिंग में एक मोनोमर से फाइबर 23,24,25 में एक डिमर में बदल जाता है।दिनांक 16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29 तक अध्ययन किए गए सभी परिस्थितियों में एनटी अत्यधिक घुलनशील और पेचदार बना हुआ है, जिसने विषम प्रोटीन के उत्पादन के लिए घुलनशीलता-बढ़ाने वाले लेबल के रूप में इसके विकास को प्रेरित किया।
पुनर्योगज मिनी स्पाइडर रेशम प्रोटीन, जिसमें शुद्धिकरण के लिए एक एनटी, एक लघु दोहराव क्षेत्र, एक सीटी और एक His6 टैग (His-NT2RepCT) शामिल है, देशी मकड़ी रेशम प्रोटीन के रूप में जलीय बफर में घुलनशील है और रेशम मकड़ी की मूल महत्वपूर्ण विशेषताओं की नकल करता है। .कवरेज 25.31.उसके-NT2RepCT को बायोमिमेटिक मशीन का उपयोग करके निरंतर फाइबर में घुमाया जा सकता है जिसमें पीएच 8 घुलनशील कोटिंग को पीएच 525,32,33,34,35 पानी के स्नान में निकाला जाता है।ई. कोली के बायोरिएक्टर किण्वन, His-NT2RepCT को व्यक्त करने और उसके बाद के उपचार के परिणामस्वरूप शुद्धिकरण के बाद 14 ग्राम/लीटर से अधिक उपज प्राप्त हुई।उच्च उपज, उच्च घुलनशीलता, और अम्लीय स्थितियों के लिए His-NT2RepCT की पर्याप्त प्रतिक्रिया सभी NT23, 25, 34 को जिम्मेदार ठहराया जाता है।
यहां हम 37 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रोटीन समाधान को इनक्यूबेट करके अकेले एनटी सहित पुनः संयोजक स्पिड्रोइन प्रोटीन से पारदर्शी हाइड्रोजेल के तेजी से गठन की रिपोर्ट करते हैं।थियोफ्लेविन टी प्रतिदीप्ति (टीएचटी), फूरियर ट्रांसफॉर्म इंफ्रारेड स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफटीआईआर), परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी (एनएमआर) और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) का उपयोग करके, हमने पाया कि एनटी और माइक्रोस्पाइडर प्रोटीन β-शीट्स और अमाइलॉइड-जैसे फाइब्रिल में संरचनात्मक परिवर्तन से गुजरते हैं। जब जैल बनते हैं.इसके अलावा, एनटी और हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) या प्यूरीन न्यूक्लियोसाइड फॉस्फोरिलेज़ (पीएनपी) के संलयन प्रोटीन पूरी तरह कार्यात्मक संलयन टुकड़ों के साथ हाइड्रोजेल बनाते हैं।विषम मेजबानों में उच्च-थ्रूपुट अभिव्यक्ति, शारीरिक स्थितियों के तहत हाइड्रोजेल के तेजी से गठन के साथ मिलकर, इंजीनियर कार्यों के साथ हाइड्रोजेल के लागत प्रभावी उत्पादन की संभावना को खोलती है।
अधिकांश रिपोर्ट किए गए पुनः संयोजक स्पिड्रोइन प्रोटीन36 के विपरीत, His-NT2RepCT पीएच 8 पर ट्रिस-एचसीएल बफर में स्थिर है और इसे बिना वर्षा25 के 500 मिलीग्राम/एमएल तक केंद्रित किया जा सकता है।इसलिए, हमें यह जानकर आश्चर्य हुआ कि 37°C पर ऊष्मायन करने पर यह प्रोटीन तेजी से ऑप्टिकली स्पष्ट, स्व-सहायक हाइड्रोजेल बनाता है (चित्र 1बी-डी)।आगे के अध्ययनों से पता चला कि His-NT2RepCT जेलेशन प्रोटीन सांद्रता (10-300 मिलीग्राम/एमएल) की एक विस्तृत श्रृंखला में हुआ और यह एकाग्रता जेलेशन समय (छवि 1 सी और अनुपूरक छवि 1) के साथ विपरीत रूप से सहसंबद्ध थी।यह पता लगाने के लिए कि His-NT2RepCT के कौन से भाग हाइड्रोजेल निर्माण में मध्यस्थता करते हैं, फिर हमने फ्लास्क उलटा परख (चित्रा 1 ए, बी) का उपयोग करके प्रत्येक डोमेन की व्यक्तिगत रूप से और विभिन्न संयोजनों में जांच की।अवक्षेपित 2रेप (चित्र 1बी) को छोड़कर, पुनः संयोजक स्पिड्रोइन के सभी परीक्षण किए गए अंशों ने 1 घंटे से भी कम समय में जैल (300 मिलीग्राम/एमएल की प्रोटीन सांद्रता पर) का निर्माण किया।इससे पता चलता है कि एनटी और सीटी अकेले, संयोजन में, या दोहराव से जुड़े हुए, 37 डिग्री सेल्सियस पर जेल कर सकते हैं और His6 टैग इस प्रक्रिया को किसी भी महत्वपूर्ण सीमा तक प्रभावित नहीं करता है।आम धारणा को देखते हुए कि एनटी एक अत्यधिक घुलनशील और स्थिर प्रोटीन है, और पुनः संयोजक स्पिड्रोइन हाइड्रोजेल की पिछली रिपोर्टों ने दोहराए गए क्षेत्रों और/या सीटी में गठनात्मक परिवर्तनों के लिए जेलेशन प्रभाव को जिम्मेदार ठहराया है, एनटी स्वयं ही ऐसा कर सकता है।जेलेशन की खोज अप्रत्याशित थी.अनुपूरक तालिका 1) 37, 38, 39। उल्लेखनीय रूप से, एनटी पहले से ही 10 मिनट के भीतर ≥ 300 मिलीग्राम/एमएल (छवि 1 सी) की एकाग्रता पर जमा हो गया।एनटी की विभिन्न सांद्रता के साथ शीशी व्युत्क्रमण प्रयोगों से पता चला कि 50 मिलीग्राम/एमएल से अधिक पर एनटी समाधान संबंधित एकाग्रता (डब्ल्यू/वी, चित्र 1सी) पर His-NT2RepCT की तुलना में तेजी से घुल जाता है।
इस कार्य में अध्ययन किए गए विभिन्न स्पाइडरॉइन निर्माणों का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व।विभिन्न पुनः संयोजक स्पिड्रोइन प्रोटीन (300 मिलीग्राम/एमएल) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर बी जेल समय शीशी को उल्टा करके सत्यापित किया गया।ऊष्मायन के बिना तुरंत सीटी जेल (<300 मिलीग्राम/एमएल), 2रेप अवक्षेपित (300 मिलीग्राम/एमएल, 5 मिमी स्केल)।37°C पर संकेतित प्रोटीन सांद्रता पर His-NT2RepCT और NT का जेल समय।d मकड़ी के साथ His-NT2RepCT और NT हाइड्रोजेल की तस्वीरें और नीचे मुद्रित अक्षर "NT" क्रमशः (दोनों 200 mg/mL, स्केल बार 5 मिमी)।
विभिन्न पुनः संयोजक स्पिड्रोइन प्रोटीन द्वारा गठित हाइड्रोजेल में थोड़ा अलग रंग होता है, और नग्न आंखों के अवलोकन से पारदर्शिता की अलग-अलग डिग्री दिखाई देती है (छवि 1 बी)।एनटी जैल असाधारण रूप से स्पष्ट होते हैं जबकि अन्य जैल अपारदर्शी हो जाते हैं।बेलनाकार ट्यूबों में डाले गए उसके-NT2RepCT और NT जैल को साँचे से यथावत हटाया जा सकता है (चित्र 1d)।
यह जांचने के लिए कि क्या प्राकृतिक मकड़ी रेशम कोटिंग्स उन परिस्थितियों में मेल खाती हैं जो अब पुनः संयोजक स्पाइडरिन प्रोटीन के जमाव का कारण बनती हैं, कोटिंग्स को स्वीडिश ब्रिज स्पाइडर (लारिनियोइड्स स्कोलोपेटेरियस) की बड़ी एम्पुला ग्रंथि से एकत्र किया गया था।कोटिंग्स को 50 मिलीग्राम/एमएल (मापे गए सूखे वजन के आधार पर) पर 20 एमएम ट्रिस-एचसीएल बफर में संग्रहीत किया गया था, लेकिन 37 डिग्री सेल्सियस (पूरक चित्रा 2 ए) पर 21 दिन के ऊष्मायन के दौरान कोई जमाव नहीं देखा गया था।
इन जैल की मात्रा निर्धारित करने के लिए, जेलेशन प्रक्रिया का अध्ययन करने और समग्र यांत्रिक गुणों को निर्धारित करने के लिए रियोलॉजिकल माप का उपयोग किया जा सकता है।विशेष रूप से, ऊंचे तापमान पर भंडारण मापांक (लोच) की निगरानी से गेलिंग तापमान के साथ-साथ कोटिंग के विस्कोलेस्टिक गुणों के बारे में जानकारी मिल सकती है।तापमान वृद्धि प्रयोग (प्राकृतिक रेशम स्टॉक समाधानों का उपयोग करके पिछले अध्ययनों के आधार पर 25-45 डिग्री सेल्सियस पर 1 डिग्री सेल्सियस/मिनट का उपयोग करके) 40,41 से पता चला कि बढ़ते तापमान के साथ His-NT2RepCT और NT समाधानों के भंडारण मॉड्यूल में वृद्धि हुई है।वृद्धि हुई थी (चित्र 2 और अनुपूरक चित्र 3)।उल्लेखनीय रूप से, NT मॉड्यूल His-NT2RepCT की तुलना में कम तापमान पर बढ़ने लगा, जो कि तेज़ जेल समय के अनुरूप था जब NT को सीधे His-NT2RepCT के साथ 37°C पर इनक्यूबेट किया गया था (चित्र 1)।तापमान में बाद की गिरावट के बाद, भंडारण मापांक कम मूल्यों पर वापस नहीं आया और हानि मापांक से ऊपर बना रहा (पूरक चित्र 3 देखें), जो थर्मल रूप से अपरिवर्तनीय स्थिर जेलेशन को दर्शाता है।जेलेशन के बाद, 100-500 mg/mL की सांद्रता पर His-NT2RepCT हाइड्रोजेल के लिए अंतिम लोचदार मापांक 15 से 330 kPa तक था, और NT हाइड्रोजेल (100-500 mg/mL) के लिए अंतिम लोचदार मापांक 2 से 1400 तक था। केपीए (चित्र, 2 और संपूर्ण रैंप डेटा) अनुपूरक चित्र 3 देखें)।
ए His-NT2RepCT (300 mg/mL) और b NT (300 mg/mL) की माप के दौरान झटकों के साथ तापमान में बदलाव।तीर तापमान की प्रवृत्ति को इंगित करते हैं, और स्टोरेज मॉड्यूल डेटा की हल्की छायांकन निर्माता द्वारा निर्दिष्ट की तुलना में उपकरण के लिए कम टॉर्क मूल्यों पर परीक्षण को दर्शाती है, जो बढ़ते शोर का कारण है।सी ऊंचे तापमान (100, 300, और 500 मिलीग्राम/एमएल) के बाद His-NT2RepCT और NT का अंत-मॉड्यूल संचय।सभी मॉड्यूल रीडिंग 0.1 हर्ट्ज की आवृत्ति पर ली जाती हैं।
जमाव से जुड़े गठनात्मक परिवर्तनों की जांच के लिए एक संभावित विधि के रूप में, हमने 37 डिग्री सेल्सियस पर जमाव से पहले और बाद में His-NT2RepCT और NT का एफटीआईआर स्पेक्ट्रा रिकॉर्ड किया (चित्र 3ए,बी)।जैसा कि अपेक्षित था, His-NT2RepCT और NT समाधानों का स्पेक्ट्रा 1645 सेमी-1 पर एक स्पष्ट बैंड के साथ, α-हेलिक्स/यादृच्छिक कुंडल माध्यमिक संरचना दिखाने वाले प्रोटीन से मेल खाता है।दोनों हाइड्रोजेल के लिए, जेलेशन के परिणामस्वरूप मध्य I बैंड में लगभग 1617 सेमी-1 और 1695 सेमी-1 (छवि 3 ए, बी) पर दो भुजाओं का निर्माण हुआ, जो एंटीपैरल समानांतर β-शीट संरचनाओं के गठन का संकेत देता है।इन परिवर्तनों को संबंधित दूसरे व्युत्पन्न और अंतर जेलेशन स्पेक्ट्रा (पूरक छवि 4 बी) में भी स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है।NT β-लेयर के दो बैंड His-NT2RepCT की तुलना में अधिक स्पष्ट थे, जो दर्शाता है कि NT हाइड्रोजेल में β-लेयर बैंड की कुल सामग्री NT2RepCT हाइड्रोजेल की तुलना में अधिक थी।
37°C पर (समाधान) और बाद में (जेल) ऊष्मायन से पहले His-NT2RepCT और b NT (दोनों 500 mg/mL) का एक FTIR अवशोषण स्पेक्ट्रा।सी पुनः निलंबित 50 मिलीग्राम/एमएल एनटी2आरईपीसीटी जैल और डी एनटी की टीईएम छवियां।स्केल बार 200 एनएम.His-NT2RepCT और NT हाइड्रोजेल के ई फाइबर व्यास।n = 100 मापे गए तंतु, पी <0.0001।त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन दर्शाती हैं।त्रुटि पट्टियों का केंद्र माध्य है।सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए एक अयुग्मित टी-परीक्षण (दो-पूंछ) का उपयोग किया गया था।बिना हिलाए 37 डिग्री सेल्सियस पर विभिन्न पुनः संयोजक स्पिड्रोइन प्रोटीन (100 मिलीग्राम/एमएल) की एफ टीएचटी प्रतिदीप्ति।0%, 5%, 10% और 20% बीजों के साथ 100 मिलीग्राम/एमएल एनटी जेल से जी एनटी (100 मिलीग्राम/एमएल) टीकाकरण प्रयोग।
ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) का उपयोग करके जेल के विश्लेषण से पता चला कि हाइड्रोजेल में अमाइलॉइड जैसे फाइब्रिल होते हैं (चित्र 3सी, 3डी)।एनटी-गठित तंतु लम्बे (5-12 एनएम व्यास में) और अशाखित थे, जबकि उनके-एनटी2आरईपीसीटी तंतु लंबाई में छोटे और व्यास में काफी व्यापक (7-16 एनएम) थे (चित्र 3ई)।इन परिणामों ने हमें थियोफ्लेविन टी (टीएचटी) परख का उपयोग करके फाइब्रोसिस की गतिशीलता का पालन करने की अनुमति दी।सभी पुनः संयोजक स्पिड्रोइन प्रोटीन के लिए, जब नमूनों को 37 डिग्री सेल्सियस (छवि 3 एफ, अनुपूरक छवि 5 ए) पर ऊष्मायन किया गया तो फ्लोरोसेंट सिग्नल बढ़ गया।इस खोज के अनुरूप, जेलिंग स्थितियों के तहत एनटी और हिज-एनटी2रेपसीटी की सूक्ष्म जांच से टीएचटी-पॉजिटिव समुच्चय के ध्यान देने योग्य स्थानीय संचय के बिना टीएचटी प्रतिदीप्ति में एक समान वृद्धि का पता चला (पूरक छवि 5 बी, सी)।टीएचटी-पॉजिटिव फाइब्रिल्स का गठन एनटी और हिज-एनटीसीटी टर्बिडिटी (सप्लीमेंट्री छवि 5डी) में वृद्धि के साथ नहीं था, जिसका अर्थ है कि जेल में फाइब्रिल्स का एक नेटवर्क जेल स्पष्टता से समझौता किए बिना बन सकता है।पूर्व-निर्मित तंतुओं की थोड़ी मात्रा जोड़कर बीजारोपण करने से कुछ अमाइलॉइड्स42,43,44 के तंतुओं के निर्माण में काफी तेजी आ सकती है, लेकिन एनटी हाइड्रोकोआगुलंट्स के घोल में 5%, 10% या 20% (w/w) NT जोड़ने से।बीजारोपण प्रभाव (चित्र 3जी)।शायद यह इस तथ्य के कारण है कि हाइड्रोजेल में तंतु अपेक्षाकृत स्थिर होते हैं और इन्हें बीज के रूप में उपयोग नहीं किया जा सकता है।
उच्च तापमान पर पुनः संयोजक स्पिड्रोइन प्रोटीन के अप्रत्याशित व्यवहार ने जेल गठन से जुड़े गठन संबंधी परिवर्तनों की पहचान करने के लिए आगे परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी अध्ययन को प्रेरित किया।समय के साथ 37°C पर रिकॉर्ड किए गए His-NT2RepCT समाधानों के NMR स्पेक्ट्रा से पता चला कि CT अभी भी आंशिक रूप से मुड़ा हुआ था, जबकि NT और 2Rep सिग्नल गायब हो गए थे (चित्र 4a), यह सुझाव देते हुए कि यह मुख्य रूप से NT और 2Rep था जो आंशिक रूप से His- के गठन को नियंत्रित करता था। NT2RepCT हाइड्रोजेल।सीटी सिग्नल को भी उसकी मूल तीव्रता के 20% तक क्षीण किया गया था, जिससे पता चलता है कि सीटी भी ज्यादातर स्थिर है और हाइड्रोजेल संरचना में शामिल है।सीटी के एक छोटे से हिस्से के लिए, जो प्रीइंक्यूबेटेड नमूने के समान मोबाइल है और इस प्रकार समाधान एनएमआर द्वारा देखा जाता है, स्पेक्ट्रा में पहले 10 संरचित अवशेषों के लिए संकेतों की कमी होती है, संभवतः His-NT2Rep के संलग्न हिस्से के कठिन स्थिरीकरण के कारण।हाइड्रोजेल की स्थिति -NT2RepCT के एनएमआर स्पेक्ट्रा ने α-हेलिकॉप्टर और β-परतों की प्रमुख उपस्थिति और, कुछ हद तक, यादृच्छिक कुंडल संरचना (छवि 4 बी) का खुलासा किया।केवल एनटी में मौजूद मेथियोनीन अवशेषों के रासायनिक बदलाव विश्लेषण से पता चला कि इस डोमेन को β-शीट संरचना में बदल दिया गया था।समाधान में एनटी के समय-निर्भर स्पेक्ट्रा ने सिग्नल की तीव्रता (छवि 4 सी) में एक समान कमी दिखाई, और एनटी हाइड्रोजेल के ठोस-अवस्था एनएमआर ने दिखाया कि अधिकांश एनटी अवशेष β-शीट संरचनाओं (छवि 4 डी) में परिवर्तित हो गए थे।एकत्रीकरण की प्रवृत्ति के कारण 2Rep की संरचना को अलग से निर्धारित नहीं किया जा सका।हालाँकि, NTCT और His-NT2RepCT हाइड्रोजेल की ठोस अवस्था NMR स्पेक्ट्रा बहुत समान दिखती है (छवि 4 बी; अनुपूरक चित्र 6 बी), यह सुझाव देती है कि 2Rep ने His-NT2RepCT हाइड्रोजेल के संरचनात्मक भाग में बहुत कम योगदान दिया है।सीटी हाइड्रोजेल के लिए, α-हेलिकॉप्टर, β-शीट और यादृच्छिक पेचदार माध्यमिक संरचनाएं मौजूद पाई गईं (पूरक छवि 6d)।इससे पता चलता है कि CT के कुछ हिस्से α-हेलिकॉप्टर बने रहते हैं जबकि अन्य β-शीट बन जाते हैं।इस प्रकार, एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी के परिणाम बताते हैं कि एनटी हाइड्रोजेल निर्माण के लिए महत्वपूर्ण है और 2Rep और CT के साथ संलयन पर β-शीट संरचना में भी बदल जाता है।इसके अनुरूप, हमने हाल ही में पाया कि एनटी डोमेन के सभी पांच हेलिकॉप्टरों में अमाइलॉइड स्थानिक ज़िपर बनने की संभावना है, और वाल्ट्ज एल्गोरिदम ने हेलिक्स 1 (छवि 4e) में एक अमाइलॉइडोजेनिक क्षेत्र की भविष्यवाणी की है।
15N-HSQC का 2D स्पेक्ट्रा 10 mg/mL His-NT2RepCT सॉल्यूशन पहले (नीला) और ऊष्मायन के 19 घंटे बाद (लाल) 37°C पर।लाल स्पेक्ट्रम में व्यक्तिगत क्रॉस शिखर और नीले स्पेक्ट्रम में F24, G136, पॉलीए को एकल अक्षर अमीनो एसिड प्रतीकों और अवशेष संख्याओं द्वारा दर्शाया गया है।इनसेट एनटी, 2रेप और सीटी डोमेन से चयनित अवशेषों के लिए समय पर सिग्नल की तीव्रता की निर्भरता दिखाते हैं।b His-NT2RepCT हाइड्रोजेल का सॉलिड-स्टेट रेडियोफ्रीक्वेंसी (RFDR) स्पेक्ट्रा।आरएफडीआर स्पेक्ट्रा में देखे गए Cα/Cβ अवशेषों के सहसंबंधों को मॉडल पेप्टाइड रासायनिक बदलावों और आंकड़ों82,83 और उनकी माध्यमिक संरचनाओं से प्राप्त मूल्यों के साथ तुलना करके निर्धारित किया गया था।एसएसबी - घूमने वाला साइडबैंड।सी 36 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के दौरान 15एन-एचएसक्यूसी 10 मिलीग्राम/एमएल एनटी समाधान का एक-आयामी स्पेक्ट्रा।इनसेट समय बनाम वॉल्यूमेट्रिक तीव्रता दिखाता है।डी एनटी हाइड्रोजेल की ठोस अवस्था आरएफडीआर स्पेक्ट्रा।आरएफडीआर स्पेक्ट्रा में देखे गए Cα/Cβ अवशेषों और उनकी माध्यमिक संरचनाओं के सहसंबंध दर्शाए गए हैं।ई जिपर डेटाबेस (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) से NT45.79 फाइब्रिलेशन प्रवृत्ति प्रोफ़ाइल पर आधारित है।हेक्सापेप्टाइड की स्थानिक बिजली शिफ्ट विंडो की रोसेटा ऊर्जा को kcal/mol में दिखाया गया है।लाल पट्टियाँ उच्च फाइब्रोसिस प्रवृत्ति वाले हेक्सापेप्टाइड्स को दर्शाती हैं (रोसेटा ऊर्जा -23 किलो कैलोरी/मोल से नीचे; बिंदीदार रेखा के नीचे)।हरी पट्टियाँ दहलीज के ऊपर रोसेटा ऊर्जा वाले टुकड़ों को इंगित करती हैं और इसलिए स्टेरिक ज़िपर बनने की संभावना कम होती है।प्रोलाइन वाले टुकड़ों को विश्लेषण (स्तंभों के बिना) से बाहर रखा गया था।वर्ग वाल्ट्ज एल्गोरिथम81 (https://waltz.switchlab.org) द्वारा अनुमानित अमाइलॉइडोसिस के क्षेत्रों को दर्शाते हैं।एनटी के अमीनो एसिड अवशेषों का क्रम शीर्ष पर है, और β माध्यमिक संरचना (ठोस-अवस्था एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा निर्धारित) में पाए जाने वाले अवशेषों के प्रकार को लाल रंग में दिखाया गया है।पाँच NT α-हेलीकॉप्टरों की स्थिति को (H1-H5)28 के रूप में निर्दिष्ट किया गया है।
पीएच <6.5 पर, एचटी मंद हो जाता है, गर्मी या यूरिया-प्रेरित विकृतीकरण18 के प्रति प्रतिरोधी होता है।यह स्पष्ट करने के लिए कि एनटी डिमराइजेशन और स्थिरता जेलेशन को कैसे प्रभावित करती है, 100 मिलीग्राम/एमएल एनटी युक्त समाधानों को शीशी उलटा परीक्षण का उपयोग करके पीएच 8, 7 और 6 पर नियंत्रित किया गया था।एनटी नमूनों को पीएच 8 और 7 पर इनक्यूबेट किया गया और 30 मिनट के बाद 37 डिग्री सेल्सियस पर जेल में डाल दिया गया, लेकिन पीएच 8 जेल साफ रहा, जबकि पीएच 7 जेल में एक दृश्य अवक्षेप दिखा (चित्र 5ए)।इसके विपरीत, पीएच 6 पर एचटी युक्त घोल ने जेल नहीं बनाया, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के बाद एक बड़ा अवक्षेप देखा जा सकता है।इससे पता चलता है कि डिमर स्वयं और/या मोनोमर्स की तुलना में उनकी उच्च स्थिरता जमाव को रोकती है।पीएच 7 और 6 पर एनटी के लिए एक अवक्षेप का गठन अपेक्षित नहीं था, क्योंकि यह बताया गया है कि एनटी 200 मिलीग्राम/एमएल27 पर घुलनशील है, गर्मी विकृतीकरण के बाद आसानी से वापस आ जाता है, और कम मूल्यों पर एक α-हेलिक्स भी बनाए रखता है। पीएच 18. इन विसंगतियों के लिए एक संभावित स्पष्टीकरण यह है कि पहले बताए गए प्रयोग कमरे के तापमान या उससे नीचे, या अपेक्षाकृत कम प्रोटीन सांद्रता16,18,19 पर किए गए थे।
37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के बाद पीएच 8, 7, 6 और 154 मिमी NaCl (पीएच 8) पर एनटी शीशी उलटा परीक्षण (100 मिलीग्राम/एमएल)।बी एनटी सीडी स्पेक्ट्रा क्रमशः 154 एमएम NaF और 154 एमएम NaCl के साथ और बिना।222 एनएम पर मोलर अण्डाकारता प्राकृतिक सिलवटों के अनुपात में परिवर्तित हो जाती है।सी एनटी उलटा परख (100 मिलीग्राम/एमएल) एनटी* (37 डिग्री सेल्सियस और 60 डिग्री सेल्सियस), एनटीए72आर (37 डिग्री सेल्सियस), और उसका-एनटी-एल6 (37 डिग्री सेल्सियस और 60 डिग्री सेल्सियस)।NT म्यूटेंट NT*, NTA72R, और His-NT-L6 का d सीडी स्पेक्ट्रा।222 एनएम पर मोलर अण्डाकारता प्राकृतिक सिलवटों के अनुपात में परिवर्तित हो जाती है।ई NTFlSp, NTMiSp का व्युत्क्रम परीक्षण और कम NTMiSp (100 mg/mL)।स्केल बार 5 मिमी.NT, NTFlSp, NTMiSp और कम NTMiSp का f सीडी स्पेक्ट्रा।222 एनएम पर मोलर अण्डाकारता प्राकृतिक सिलवटों के अनुपात में परिवर्तित हो जाती है।25 डिग्री सेल्सियस और 95 डिग्री सेल्सियस पर पूर्ण एनटी स्पेक्ट्रा को पूरक चित्र 8 में दिखाया गया है।
शारीरिक नमक सांद्रता एनटी सबयूनिट्स के बीच इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन और एनटी के निम्न pH18 में स्थानांतरण के डिमराइजेशन को निर्धारित करती है।हमने पाया कि 154 एमएम NaCl और NaF की उपस्थिति ने वास्तव में क्रमशः जेलेशन को रोक दिया (छवि 5 ए, बी; अनुपूरक छवि 2 बी) और इन लवणों ने एनटी मोनोमर्स (छवि 5 बी, अनुपूरक छवि 8) की थर्मल स्थिरता में वृद्धि की। .यह यह भी सुझाव देता है कि मंदीकरण के बजाय स्थिरता में वृद्धि, जेल निर्माण को रोकती है।
जेलेशन में प्रोटीन डिमराइजेशन और स्थिरता की भूमिका का और पता लगाने के लिए, हमने दो म्यूटेंट, एनटी* और एनटीए72आर का उपयोग किया, जो कम pH28.30 पर भी मोनोमेरिक रहते हैं।एनटी* एक डबल चार्ज रिवर्सल म्यूटेंट है जिसमें मोनोमर का स्पष्ट द्विध्रुवीय चार्ज वितरण चपटा होता है, जो डिमराइजेशन को रोकता है और मोनोमर स्थिरता में भारी वृद्धि करता है।NTA72R एक आवेशित द्विध्रुव है, लेकिन Arg-प्रतिस्थापित Ala डिमर सीमा पर स्थित है, इसलिए उत्परिवर्तन डिमराइजेशन के लिए आवश्यक सबयूनिट इंटरैक्शन में हस्तक्षेप करते हैं।37°C पर ऊष्मायन पर, NT* ने हाइड्रोजेल नहीं बनाया, जबकि NTA72R ने 15 मिनट के लिए एक अपारदर्शी जेल बनाया (चित्र 5c)।चूँकि NT* और NTA72R दोनों डिमराइज़ नहीं हो सकते हैं, लेकिन मोनोमर स्थिरता (चित्र 5d) में भिन्न हैं, ये परिणाम दृढ़ता से सुझाव देते हैं कि उच्च थर्मोडायनामिक स्थिरता NT को जेलिंग से रोकती है।यह इस तथ्य से भी समर्थित है कि HT* एक जेल बनाता है जब यह उच्च तापमान पर अस्थिर होता है (60°C पर 8 मिनट के बाद; चित्र 5c)।यह पहले दिखाया गया है कि एनटी में मेथियोनीन की उच्च सामग्री इसकी प्राकृतिक तह को द्रवित करती है और छह मेट से लेउ विकल्प (यहां हिज-एनटी-एल 6 के रूप में संदर्भित) एनटी 46 मोनोमर को मजबूती से स्थिर करते हैं।इस धारणा के आधार पर कि एनटी जेल निर्माण के लिए संरचनात्मक लचीलापन आवश्यक है, हमने पाया कि हिस-एनटी-एल6 स्थिर उत्परिवर्ती 37 डिग्री सेल्सियस (चित्र 5सी, डी) पर जेल नहीं गया।हालाँकि, His-NT-L6 ने 60°С पर 60 मिनट तक ऊष्मायन करने पर एक जेल भी बनाया (चित्र 5c)।
एनटी की β-शीट संरचनाओं में बदलने और हाइड्रोजेल बनाने की क्षमता स्पाइड्रोइन के कुछ लेकिन सभी एनटी डोमेन पर लागू नहीं होती है।विभिन्न रेशम प्रकारों और मकड़ी प्रजातियों, ट्राइकोनेफिला क्लैवाइप्स (एनटीएफएलएसपी) से एनटी ने अपेक्षाकृत कम मेथियोनीन सामग्री और उच्च तापीय स्थिरता (छवि 5 ई, एफ और पूरक तालिका 2) के बावजूद जैल का गठन किया।इसके विपरीत, कम तापीय स्थिरता और उच्च मेथियोनीन सामग्री वाले एरेनस वेंट्रिकोसस (एनटीएमआईएसपी) से छोटे एम्पुलर प्रोटीन स्पिड्रोइन से एनटी ने हाइड्रोजेल नहीं बनाया (पूरक तालिका 2 और चित्र 5ई, एफ)।उत्तरार्द्ध इंट्रामोल्युलर डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड29,47 की उपस्थिति से जुड़ा हो सकता है।लगातार, जब NTMiSp के डाइसल्फ़ाइड बांड कम हो गए, तो 10 मिनट के लिए 37°C पर ऊष्मायन के बाद इसने एक हाइड्रोजेल बनाया (चित्र 5e)।निष्कर्ष में, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि संरचनात्मक लचीलापन एनटी से जेल के निर्माण के लिए एक महत्वपूर्ण, लेकिन एकमात्र मानदंड नहीं है।एक अन्य कारक जो प्रासंगिक हो सकता है वह है अमाइलॉइड फाइब्रिल बनाने की प्रवृत्ति, और जिपर डेटाबेस और वाल्ट्ज एल्गोरिदम के साथ विश्लेषण ने जैल बनाने की क्षमता और अमाइलॉइडोजेनिक क्षेत्रों की उपस्थिति के साथ-साथ अनुमानित क्षेत्रों की सीमा के बीच एक संबंध दिखाया है। स्टेरिक ज़िपर बनाने के लिए.एक सहसंबंध था (पूरक तालिका 2 और अनुपूरक चित्र 9)।
अनुकूल परिस्थितियों में फाइब्रिल बनाने और जैल बनाने की एनटी की क्षमता ने हमें यह अनुमान लगाने के लिए प्रेरित किया कि अन्य प्रोटीन टुकड़ों के साथ एनटी फ्यूजन अभी भी फ्यूजन भागीदारों के पूर्ण कार्य के साथ जैल बना सकता है।इसका परीक्षण करने के लिए, हमने एनटी के सी-टर्मिनस पर क्रमशः ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) और प्यूरीन न्यूक्लियोसाइड फॉस्फोरिलेज़ (पीएनपी) पेश किया।परिणामी संलयन प्रोटीन को ई. कोली में बहुत उच्च अंतिम उपज (हिज़-एनटी-जीएफपी और हिज़-एनटी-पीएनपी के लिए क्रमशः 150 मिलीग्राम/लीटर और 256 मिलीग्राम/लीटर शेक फ्लास्क कल्चर) के साथ व्यक्त किया गया था, जो दिखाया गया है उसके अनुरूप है। एनटी रेफ से जुड़े अन्य प्रोटीन के लिए।30. His-NT-GFP (300mg/mL) और His-NT-PNP (100mg/mL) संलयन प्रोटीन ने 37°C पर 2 घंटे और 6.5 घंटे के बाद जैल बनाया और, महत्वपूर्ण बात यह है कि GFP अंश अपरिवर्तित रहा।जमाव के बाद देखा गया, जमाव के बाद प्रारंभिक प्रतिदीप्ति तीव्रता का 70% शेष रहता है (चित्र 6ए)।उसके-एनटी-पीएनपी समाधान और जैल में पीएनपी गतिविधि को मापने के लिए, हमें एनटी के साथ संलयन प्रोटीन को पतला करना पड़ा क्योंकि शुद्ध तैयारी की एंजाइमैटिक गतिविधि गेलिंग सांद्रता पर परख की पहचान सीमा से बाहर थी।0.01 मिलीग्राम/एमएल हिज-एनटी-पीएनपी और 100 मिलीग्राम/एमएल एनटी युक्त मिश्रण से बने जेल ने प्रीइंक्यूबेटेड नमूनों की प्रारंभिक एंजाइमेटिक गतिविधि का 65% बरकरार रखा (चित्र 6बी)।माप के दौरान जेल बरकरार रहा (पूरक चित्र 10)।
दृश्यमान और यूवी प्रकाश के तहत हिस-एनटी-जीएफपी (300 मिलीग्राम/एमएल) और हिस-एनटी-जीएफपी हाइड्रोजेल (300 मिलीग्राम/एमएल) युक्त उलटी शीशी के जमाव से पहले और बाद में सापेक्ष प्रतिदीप्ति तीव्रता।अंक व्यक्तिगत माप दिखाते हैं (एन = 3), त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन दिखाती हैं।औसत मान त्रुटि पट्टियों के केंद्र में दिखाया गया है।बी पीएनपी गतिविधि फ्लोरोमेट्रिक विश्लेषण द्वारा एनटी (100 मिलीग्राम/एमएल) और 0.01 मिलीग्राम/एमएल उसके-एनटी-पीएनपी और 100 मिलीग्राम/एमएल न्यू ताइवान डॉलर युक्त मिश्रण और जैल का उपयोग करके प्राप्त की गई थी।इनसेट में एक उलटी शीशी दिखाई देती है जिसमें हिज-एनटी-पीएनपी (5 मिमी स्केल बार) युक्त हाइड्रोजेल होता है।
यहां, हम 37 डिग्री सेल्सियस (चित्र 1) पर एक प्रोटीन समाधान को इनक्यूबेट करके एनटी और अन्य पुनः संयोजक स्पिड्रोइन प्रोटीन से हाइड्रोजेल के गठन की रिपोर्ट करते हैं।हम दिखाते हैं कि जमाव α-हेलिसेस के β-परतों में परिवर्तन और अमाइलॉइड-जैसे फाइब्रिल के गठन से जुड़ा है (चित्र 3 और 4)।यह खोज आश्चर्यजनक है क्योंकि एनटी कुंडलित गोलाकार पांच-हेलिक्स बंडल हैं जो कई दिनों तक 4°C पर 200 मिलीग्राम/एमएल से अधिक की सांद्रता पर अत्यधिक उच्च घुलनशीलता और उच्च स्थिरता के लिए जाने जाते हैं।इसके अलावा, एनटी µM में कम प्रोटीन सांद्रता पर ताप विकृतीकरण के बाद आसानी से पुनः निर्मित हो जाते हैं।हमारे परिणामों के अनुसार, फाइब्रिल गठन के लिए >10 मिलीग्राम/एमएल प्रोटीन सांद्रता और थोड़े ऊंचे तापमान के संयोजन की आवश्यकता होती है (चित्र 1)।यह इस विचार के अनुरूप है कि अमाइलॉइड फाइब्रिल गोलाकार रूप से मुड़े हुए प्रोटीन से बन सकते हैं जो शारीरिक स्थितियों 48 के तहत थर्मल उतार-चढ़ाव के कारण आंशिक रूप से प्रकट अवस्था में होते हैं।इस रूपांतरण से गुजरने वाले प्रोटीन के उदाहरणों में इंसुलिन49,50, β2-माइक्रोग्लोबुलिन, ट्रांसथायरेटिन और लाइसोजाइम51,52,53 शामिल हैं।यद्यपि एनटी अपनी मूल अवस्था में एक α-हेलिक्स है, पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला का लगभग 65% स्टेरिक जिपर गठन (छवि 4ई) 45 के साथ संगत है।चूंकि मोनोमर गतिशील रूप से गतिशील46 है, यह इन संभावित अमाइलॉइडोजेनिक क्षेत्रों को मध्यम ऊंचे तापमान पर उजागर कर सकता है और कुल प्रोटीन की उच्च सांद्रता पर अमाइलॉइड फाइब्रिल गठन54 के लिए एक महत्वपूर्ण एकाग्रता तक पहुंच सकता है।इस तर्क के बाद, हमने स्पिड्रोइन एकाग्रता और जेलेशन समय (छवि 1 सी) के बीच एक नकारात्मक सहसंबंध पाया, और यदि मोनोमेरिक एनटी संरचना को उत्परिवर्तन (एनटी *, हिज-एनटी-एल 6) या नमक के अतिरिक्त द्वारा स्थिर किया जाता है, तो इसे रोका जा सकता है। हाइड्रोजेल का निर्माण (चित्र 5)।
ज्यादातर मामलों में, अमाइलॉइड फाइब्रिल अवक्षेप के रूप में घोल से गायब हो जाते हैं, लेकिन कुछ शर्तों के तहत वे हाइड्रोजेल55,56,57 बना सकते हैं।हाइड्रोजेल बनाने वाले तंतुओं में आम तौर पर उच्च पहलू अनुपात होता है और हमारे परिणामों के अनुरूप आणविक उलझाव,55,58 के माध्यम से स्थिर त्रि-आयामी नेटवर्क बनाते हैं।इन विट्रो में हाइड्रोजेल निर्माण के लिए, प्रोटीन अक्सर पूरी तरह या आंशिक रूप से प्रकट होते हैं, उदाहरण के लिए, कार्बनिक सॉल्वैंट्स, उच्च तापमान (70-90 डिग्री सेल्सियस) और/या कम पीएच (1.5-3.0)59,60,61,62 के संपर्क में आने से।यहां वर्णित स्पिड्रोइन हाइड्रोजेल को कठोर प्रसंस्करण की आवश्यकता नहीं है, न ही उन्हें हाइड्रोजेल को स्थिर करने के लिए क्रॉस-लिंकिंग एजेंटों की आवश्यकता होती है।
पहले यह बताया गया है कि स्पाइडरॉइन रिपीट और क्यूडी, जो रेशम कताई के दौरान β-शीट स्विचिंग से गुजरते प्रतीत होते हैं, हाइड्रोजेल बनाते हैं।हमारे निष्कर्षों की तुलना में, ऊष्मायन समय और/या ऊष्मायन तापमान क्रमशः काफी लंबा या अधिक था, और परिणामी हाइड्रोजेल अक्सर अपारदर्शी थे (चित्र 7 और अनुपूरक तालिका 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. तेज जेल समय के अलावा, एनटी हाइड्रोजेल >300 मिलीग्राम/एमएल (30%) ने अन्य सभी वर्णित पुनः संयोजक स्पाइडर रेशम प्रोटीन हाइड्रोजेल, साथ ही जिलेटिन, एल्गिनेट (2%), अगर (0.5%) जैसे प्राकृतिक हाइड्रोजेल से बेहतर प्रदर्शन किया। ) और कोलेजन।(0.6%) (चित्र 7 और अनुपूरक तालिकाएँ 1 और 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74।
इस अध्ययन में हाइड्रोजेल के जेल समय और लोचदार मापांक की तुलना अन्य स्पिड्रोइन-आधारित हाइड्रोजेल और चयनित प्राकृतिक हाइड्रोजेल से की गई।जेलेशन स्थितियों के विवरण के साथ संदर्भ भी दिए गए हैं।एपीएस अमोनियम परसल्फेट, कमरे का तापमान।डेटा 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74।
ऐसा प्रतीत होता है कि मकड़ियों ने भंडारण के दौरान स्पाइडरॉइन को जमने से रोकने के तरीके विकसित कर लिए हैं।रेशम ग्रंथि में प्रोटीन की उच्च सांद्रता के बावजूद, टर्मिनल डोमेन से जुड़े बड़े दोहराव क्षेत्र का मतलब है कि ग्रंथि में एनटी और सीटी की स्पष्ट एकाग्रता इस अध्ययन की सीमा पर लगभग 10-20 मिलीग्राम/एमएल से मेल खाती है।इन विट्रो में देखे गए हाइड्रोजेल निर्माण के लिए आवश्यक है।इसके अलावा, लवणों की समान सांद्रता 16 ने एनटी को स्थिर कर दिया, जैसा कि रेशम ग्रंथियों में होता है (चित्र 5बी)।ई. कोली साइटोसोल में एनटी संरचना का अध्ययन किया गया है और इन विट्रो में जांच करने की तुलना में अधिक कसकर मुड़ा हुआ पाया गया है, जो आगे संकेत देता है कि नमक या अन्य कारक विवो में इसके एकत्रीकरण को रोकते हैं।हालाँकि, एनटी की β-शीट फ़ाइब्रिल्स में बदलने की क्षमता फिलामेंट निर्माण के लिए महत्वपूर्ण हो सकती है और भविष्य के अध्ययनों में इसकी जांच की जानी चाहिए।
इस अध्ययन में देखे गए एनटी-एमिलॉइड-जैसे फाइब्रिल और हाइड्रोजेल गठन के नए पहलुओं के अलावा, हम यह भी दिखाते हैं कि इस घटना में जैव प्रौद्योगिकी और जैव चिकित्सा अनुप्रयोग हो सकते हैं (चित्र 8)।अवधारणा के प्रमाण के रूप में, हमने एनटी को जीएफपी या पीएनपी के साथ जोड़ा और दिखाया कि 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन करने पर संलयन प्रोटीन भी हाइड्रोजेल बनाता है और जीएफपी और पीएनपी अंश बड़े पैमाने पर जेलेशन के बाद अपनी गतिविधि बनाए रखते हैं (चित्र 6)।न्यूक्लियोसाइड फ़ॉस्फ़ोरिलेज़, न्यूक्लियोसाइड एनालॉग्स75 के संश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण उत्प्रेरक हैं, जो हमारी खोज को बायोफार्मास्युटिकल उद्योग के लिए प्रासंगिक बनाता है।अनुकूल परिस्थितियों में पारदर्शी हाइड्रोजेल बनाने वाले संलयन प्रोटीन को व्यक्त करने की अवधारणा एंजाइम स्थिरीकरण, नियंत्रित दवा रिलीज और ऊतक इंजीनियरिंग जैसे अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अनुकूल गुणों के साथ कार्यात्मक हाइड्रोजेल के निर्माण की अनुमति देती है।इसके अलावा, एनटी और एनटी* कुशल अभिव्यक्ति मार्कर30 हैं, जिसका अर्थ है कि एनटी और इसके वेरिएंट का उपयोग घुलनशील संलयन प्रोटीन के उच्च-थ्रूपुट उत्पादन और बाद में 3डी हाइड्रोजेल में स्थिर लक्ष्य प्रोटीन के निर्माण के लिए किया जा सकता है।
एनटी घुलनशील, α-पेचदार और कम सांद्रता (μM) और 37°C पर स्थिर है।एक ही तापमान पर, लेकिन बढ़ती सांद्रता (>10 मिलीग्राम/एमएल) पर, एनटी अमाइलॉइड-जैसे फाइब्रिल से युक्त जैल बनाता है।एनटी संलयन प्रोटीन पूरी तरह कार्यात्मक संलयन टुकड़ों के साथ फाइब्रिलर जैल भी बनाते हैं, जिससे एनटी का उपयोग करके विभिन्न प्रोटीनों को 3डी हाइड्रोजेल में स्थिर किया जा सकता है।नीचे: एनटी (पीडीबी: 4एफबीएस) और फाइबर नेटवर्क और संबंधित प्रोटीन संरचनाओं के चित्र (मान लिया गया है और पैमाने पर नहीं खींचा गया है, जीएफपी पीडीबी: 2बी3क्यू, 10.2210/पीडीबी2बी3क्यू/पीडीबी; पीएनपी पीडीबी: 4आरजे2, 10.2210/पीडीबी4आरजे2/पीडीबी)।
निर्माणों (अमीनो एसिड अनुक्रमों सहित पूरी सूची के लिए अनुपूरक तालिका 4 देखें) को प्लास्मिड पीटी7 में क्लोन किया गया और ई. कोलाई बीएल21 (डीई3) में बदल दिया गया।इंजीनियर्ड प्लास्मिड युक्त ई. कोली को कैनामाइसिन (70 मिलीग्राम/लीटर) के साथ पूरक लूरिया शोरबा में टीका लगाया गया और रात भर 30 डिग्री सेल्सियस और 250 आरपीएम पर उगाया गया।इसके बाद कल्चर को कैनामाइसिन युक्त एलबी माध्यम में 1/100 टीका लगाया गया और 30 डिग्री सेल्सियस और 110 आरपीएम पर कल्चर किया गया जब तक कि ओडी600 0.8 तक नहीं पहुंच गया।एनएमआर अध्ययनों के लिए, आइसोटोप के साथ प्रोटीन लेबलिंग के लिए बैक्टीरिया को एम9 न्यूनतम माध्यम में उगाया गया था जिसमें 2 ग्राम डी-ग्लूकोज 13सी (एल्ड्रिच) और 1 ग्राम अमोनियम क्लोराइड 15एन (कैम्ब्रिज आइसोटोप लेबोरेटरीज, इंक.) था।तापमान को 20 डिग्री सेल्सियस तक कम करें और 0.15 मिमी आइसोप्रोपाइलथियोगैलेक्टोप्रानोसाइड (अंतिम एकाग्रता) के साथ प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करें।रात भर प्रोटीन अभिव्यक्ति के बाद, कोशिकाओं को 20 मिनट के लिए 7278×g, 4°C पर काटा गया।सेल छर्रों को 20 मिमी ट्रिस-एचसीएल, पीएच 8 में फिर से निलंबित कर दिया गया और आगे के उपयोग तक जमे हुए रखा गया।पिघली हुई कोशिकाओं को 30 kPa पर एक सेल डिसरप्टर (टीएस श्रृंखला मशीन, कॉन्स्टेंट सिस्टम्स लिमिटेड, इंग्लैंड) का उपयोग करके नष्ट कर दिया गया।फिर लाइसेट्स को 25,000 ग्राम पर 30 मिनट के लिए 4°C पर सेंट्रीफ्यूज किया गया।NTMiSp के लिए, गोली को 2 एम यूरिया, 20 मिमी ट्रिस-एचसीएल, पीएच 8 में फिर से निलंबित कर दिया गया और 2 मिनट (2 सेकंड चालू/बंद, 65%) के लिए सोनिकेट किया गया, फिर 25,000 xg, 4 डिग्री सेल्सियस पर फिर से सेंट्रीफ्यूज किया गया। 30 मिनट।सतह पर तैरनेवाला को नी-एनटीए कॉलम पर लोड किया गया था, 20 मिमी ट्रिस-एचसीएल, 2 मिमी इमिडाज़ोल, पीएच 8 से धोया गया था, और अंत में प्रोटीन को 20 मिमी ट्रिस-एचसीएल, 200 मिमी इमिडाज़ोल, पीएच 8 के साथ मिलाया गया था। एनटी2रेपसीटी उत्पन्न करने के लिए और एनटीसीटी, थ्रोम्बिन पाचन हिस और एनटी के बीच साइट (थ्रक्लीव) का परिचय देता है।थ्रोम्बिन क्लीवेज साइटें His-NT-ThrCleav-2Rep (2Rep का उत्पादन करती है), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (NT का उत्पादन करती है), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (CT का उत्पादन करती है), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT में भी मौजूद हैं। .* (NT* का उत्पादन करता है), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (NTA72R का उत्पादन करता है), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (NTF1Sp का उत्पादन करता है), और His-सल्फर Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (NTMiSp का उत्पादन करता है)।निर्माणों को थ्रोम्बिन (1:1000) के साथ पचाया गया और 6-8 केडीए की आणविक भार सीमा के साथ स्पेक्ट्रा/पोर डायलिसिस झिल्ली का उपयोग करके 20 मिमी ट्रिस-एचसीएल, पीएच 8 के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर डायलाइज किया गया।डायलिसिस के बाद, समाधान को नी-एनटीए कॉलम पर लोड किया जाता है और ब्याज की प्रोटीन युक्त प्रवाह एकत्र किया जाता है।एनटीएफ1एसपी को छोड़कर, जो निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार ब्रैडफोर्ड परख का उपयोग करता था, प्रत्येक प्रोटीन के विलुप्त होने के गुणांक का उपयोग करके 280 एनएम पर यूवी अवशोषण को मापकर प्रोटीन सांद्रता निर्धारित की गई थी।शुद्धता एसडीएस पॉलीएक्रिलामाइड (4-20%) जेल वैद्युतकणसंचलन और कूमैसी ब्रिलियंट ब्लू स्टेनिंग द्वारा निर्धारित की गई थी।प्रोटीन को 20 मिनट के चक्र में 10 केडीए आणविक भार कटऑफ के साथ 4000 xg पर सेंट्रीफ्यूज फिल्टर (वीवास्पिन 20, जीई हेल्थकेयर) का उपयोग करके केंद्रित किया गया था।
प्रोटीन घोल को पिघलाएं और 1 मिलीलीटर स्पष्ट सेप्टम शीशी (8 x 40 मिमी थर्मो साइंटिफिक) में 150 μl को सावधानीपूर्वक पिपेट करें।वाष्पीकरण को रोकने के लिए ट्यूबों को पैराफिल्म से ढक दिया गया और सील कर दिया गया।नमूने (n = 3) को 37°C या 60°C पर इनक्यूबेट किया गया और जेलेशन देखने के लिए समय-समय पर उलटा किया गया।जो नमूने जम नहीं पाए, उन्हें कम से कम एक सप्ताह तक रखा गया।प्रति 10 µM प्रोटीन में 10 mM DTT के साथ NTMiSp डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड को कम करें।प्राकृतिक मकड़ी रेशम कोटिंग्स के जमाव का विश्लेषण करने के लिए, स्वीडिश ब्रिज स्पाइडर को काटा गया, दो मुख्य एम्पुलेटेड ग्रंथियों को 20 मिमी ट्रिस-एचसीएल बफर पीएच 8 के 200 μl में रखा गया और कोटिंग को ग्रंथियों से अलग करने की अनुमति देने के लिए काटा गया।.ग्रंथियों की सामग्री को बफर में भंग कर दिया जाता है, सूखे वजन के निर्धारण के लिए 50 μl (स्थिर वजन के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर खुली शीशियों के ऊष्मायन द्वारा) और 37 डिग्री सेल्सियस पर जेलेशन के लिए 150 μl।
मापने की ज्यामिति/उपकरण 20 मिमी के शीर्ष व्यास और 0.5 मिमी के अंतराल के साथ एक समानांतर प्लेट का उपयोग करके स्टेनलेस स्टील से बना है।स्टेनलेस स्टील बॉटम पेल्टियर प्लेट का उपयोग करके नमूने को 25 डिग्री सेल्सियस से 45 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें और 1 डिग्री सेल्सियस प्रति मिनट की दर से वापस 25 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।कंपन माप क्रमशः 100 मिलीग्राम/एमएल और 300-500 मिलीग्राम/एमएल के नमूनों के लिए 0.1 हर्ट्ज की आवृत्ति पर और सामग्री के रैखिक विस्कोलेस्टिक क्षेत्र में 5% और 0.5% के तनाव पर किए गए थे।वाष्पीकरण को रोकने के लिए एक कस्टम आर्द्रता कक्ष का उपयोग करें।प्रिज्म 9 का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण किया गया।
800 से 3900 सेमी-1 तक कमरे के तापमान पर इन्फ्रारेड (आईआर) स्पेक्ट्रा एकत्र करने के लिए।एटीआर डिवाइस, साथ ही स्पेक्ट्रोमीटर के माध्यम से प्रकाश पथ को प्रयोग से पहले और उसके दौरान सूखी फ़िल्टर की गई हवा से शुद्ध किया जाता है।समाधान (स्पेक्ट्रा में जल अवशोषण शिखर को कम करने के लिए 500 मिलीग्राम/एमएल) को क्रिस्टल पर पाइप किया गया था, और माप से पहले जैल (500 मिलीग्राम/एमएल) का गठन किया गया था और फिर क्रिस्टल (एन = 3) में स्थानांतरित किया गया था।1000 स्कैन 2 सेमी-1 के रिज़ॉल्यूशन और 2 के शून्य कर्तव्य चक्र के साथ रिकॉर्ड किए गए थे। दूसरे व्युत्पन्न की गणना नौ बिंदुओं की स्मूथिंग रेंज का उपयोग करके ओपस (ब्रूकर) का उपयोग करके की गई थी।एफ. मेंगेस "स्पेक्ट्राग्रिफ़ - ऑप्टिकल स्पेक्ट्रोस्कोपी सॉफ्टवेयर" का उपयोग करके स्पेक्ट्रा को 1720 और 1580 सेमी-1 के बीच समान एकीकरण क्षेत्र में सामान्यीकृत किया गया था।एटीआर-आईआर स्पेक्ट्रोस्कोपी में, एक नमूने में इन्फ्रारेड बीम की प्रवेश गहराई तरंग संख्या पर निर्भर होती है, जिसके परिणामस्वरूप उच्च तरंग संख्या की तुलना में कम तरंग संख्या पर मजबूत अवशोषण होता है।अंजीर में दिखाए गए स्पेक्ट्रा के लिए इन प्रभावों को ठीक नहीं किया गया है।3 क्योंकि वे बहुत छोटे हैं (पूरक चित्र 4)।इस आंकड़े के लिए सही स्पेक्ट्रा की गणना ब्रूकर ओपस सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके की गई थी।
सिद्धांत रूप में, एमाइड I शिखर के भीतर घटकों के विश्वसनीय विघटन के बाद प्रोटीन अनुरूपता का एक व्यापक परिमाणीकरण संभव है।हालाँकि, व्यवहार में कुछ बाधाएँ उत्पन्न होती हैं।स्पेक्ट्रम में शोर विघटन के दौरान (झूठी) चोटियों के रूप में प्रकट हो सकता है।इसके अलावा, पानी के झुकने के कारण होने वाला शिखर एमाइड I शिखर की स्थिति के साथ मेल खाता है और बड़ी मात्रा में पानी वाले नमूनों के लिए समान परिमाण हो सकता है, जैसे कि यहां अध्ययन किया गया जलीय जेल।इसलिए, हमने एमाइड I पीक को पूरी तरह से विघटित करने का प्रयास नहीं किया, और हमारी टिप्पणियों को केवल एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी जैसे अन्य तरीकों के समर्थन में माना जाना चाहिए।
50 mg/ml NT और His-NT2RepCT के घोल को रात भर 37°C पर मिलाया गया।फिर हाइड्रोजेल को 20 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 8) के साथ 12.5 मिलीग्राम/एमएल की सांद्रता तक पतला किया गया, अच्छी तरह से हिलाया गया और जेल को तोड़ने के लिए पिपेट किया गया।इसके बाद, हाइड्रोजेल को 20 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 8) के साथ 10 बार पतला किया गया, नमूने का 5 μl फॉर्मवार के साथ लेपित तांबे के ग्रिड पर लगाया गया, और अतिरिक्त नमूना ब्लॉटिंग पेपर के साथ हटा दिया गया।नमूनों को 5 μl मिलिक्यू पानी से दो बार धोया गया और 5 मिनट के लिए 1% यूरेनिल फॉर्मेट से रंगा गया।अवशोषक कागज से अतिरिक्त दाग हटा दें, फिर जाली को हवा में सुखाएं।इन ग्रिडों पर 100 केवी पर संचालित एफईआई टेक्नाई 12 स्पिरिट बायोट्विन का उपयोग करके इमेजिंग की गई थी।छवियों को वेलेटा 2k × 2k सीसीडी कैमरा (ओलंपस सॉफ्ट इमेजिंग सॉल्यूशंस, जीएमबीएच, मुंस्टर, जर्मनी) का उपयोग करके x 26,500 और x 43,000 आवर्धन पर रिकॉर्ड किया गया था।प्रत्येक नमूने (एन = 1) के लिए, 10-15 छवियां रिकॉर्ड की गईं।ImageJ (https://imagej.nih.gov/) का उपयोग छवि विश्लेषण और फाइबर व्यास (n = 100, विभिन्न फाइबर) के माप के लिए किया गया था।प्रिज्म 9 का उपयोग अयुग्मित टी-परीक्षण (दो-पूंछ) करने के लिए किया गया था।माध्य His-NT2RepCT और NT फ़ाइब्रिल्स क्रमशः 11.43 (SD 2.035) और 7.67 (SD 1.389) एनएम थे।आत्मविश्वास अंतराल (95%) -4.246 से -3.275 है।स्वतंत्रता की डिग्री = 198, पी <0.0001।
10 μM थियोफ्लेविन टी (ThT) युक्त 80 μl तरल नमूनों को कॉर्निंग 96-वेल ब्लैक बॉटम क्लियर बॉटम प्लेट्स (कॉर्निंग ग्लास 3881, यूएसए) का उपयोग करके स्थिर परिस्थितियों में तीन प्रतियों (एन = 3) में मापा गया था।440 एनएम उत्तेजना फिल्टर और 480 एनएम उत्सर्जन फिल्टर (बीएमजी लैबटेक, ऑफेनबर्ग, जर्मनी से फ्लुओस्टार गैलेक्सी) का उपयोग करके प्रतिदीप्ति अंतर दर्ज किया गया था।ThT सिग्नल न तो संतृप्त था और न ही बुझ गया था, क्योंकि ThT की विभिन्न सांद्रता वाले प्रयोग सिग्नल की तीव्रता को बदले बिना किए गए थे।धुंध माप के लिए 360 एनएम पर अवशोषण रिकॉर्ड करें।बीजारोपण प्रयोगों के लिए, 100 मिलीग्राम/एमएल जैल को 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाया गया, फिर से निलंबित किया गया, और 5%, 10% और 20% के मोलर अनुपात पर बीजारोपण के लिए उपयोग किया गया।प्रिज्म 9 का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण किया गया।
His-NT2RepCT और NT >100 mg/mL के स्टॉक को बर्फ पर पिघलाएँ और 0.22 µm फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें।नैनोड्रॉप का उपयोग करके 280 एनएम पर अवशोषण को मापकर सांद्रता की गणना की गई।स्पष्ट तल वाली 96-अच्छी काली गैर-बाध्यकारी प्लेट (कॉर्निंग) के कुओं में, नमूनों को 20 मिमी ट्रिस-एचसीएल पीएच 8 में 20 मिलीग्राम/एमएल तक पतला किया गया और 5 μM ThT (अंतिम एकाग्रता), कुल नमूना एकाग्रता के साथ मिलाया गया। 50 μl मात्रा.नमूनों को हर 10 मिनट में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेलऑब्जर्वर (ज़ीस) माइक्रोस्कोप पर प्रसारित प्रकाश चैनल और टीएचटी इमेजिंग के लिए एफआईटीसी उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर सेट के साथ चित्रित किया गया था।इमेजिंग के लिए 20x/0.4 लेंस का उपयोग किया जाता है।छवि विश्लेषण के लिए ज़ेन ब्लू (ज़ीस) और इमेजजे (https://imagej.nih.gov/) का उपयोग किया गया था।जैल को NT और His-NT2RepCT समाधानों से 50 mg/mL की सांद्रता पर 20 mM ट्रिस pH 8 और 5 µM ThT युक्त तैयार किया गया और 90 मिनट के लिए 37°C पर इनक्यूबेट किया गया।जेल के टुकड़ों को एक गैर-बाध्यकारी काली 96 अच्छी तरह से स्पष्ट निचली प्लेट में 20 मिमी ट्रिस, पीएच 8 और 5 μM ThT युक्त एक नए कुएं में स्थानांतरित किया गया था।20x/0.4 आवर्धन पर हरी प्रतिदीप्ति और उज्ज्वल क्षेत्र छवियां प्राप्त करें।ImageJ का उपयोग छवि विश्लेषण के लिए किया गया था।
समाधान एनएमआर स्पेक्ट्रा क्यूसीआई क्वाड्रुपोल रेजोनेंस पल्स्ड ग्रेडिएंट फील्ड क्रायोप्रोब (एचएफसीएन) से लैस 600 मेगाहर्ट्ज ब्रूकर एवेंस नियो स्पेक्ट्रोमीटर पर 310 K पर प्राप्त किया गया था।एनएमआर नमूनों में 13सी, 15एन लेबल वाले 10 मिलीग्राम/एमएल सजातीय प्रोटीन होते हैं, जो 20 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 8), 0.02% (डब्ल्यू/वी) NaN3, 5% डीओ (वी/वी), (एन = 1) में घुले होते हैं। .pH 6.7 पर NT2RepCT के रासायनिक बदलावों का उपयोग 15N-HSQC के 2D स्पेक्ट्रम में शिखर 23 निर्दिष्ट करने के लिए किया गया था।
13सी, 15एन-लेबल वाले हाइड्रोजेल के मैजिक एंगल स्पिनिंग सॉलिड एनएमआर (एमएएस) स्पेक्ट्रा को 3.2 मिमी 13सी/15एन{1एच} इलेक्ट्रॉन रहित जांच से सुसज्जित 800 मेगाहर्ट्ज पर ब्रूकर एवेंस III एचडी स्पेक्ट्रोमीटर पर रिकॉर्ड किया गया था।नमूना तापमान को 277 K पर एक परिवर्तनीय तापमान गैस धारा का उपयोग करके नियंत्रित किया गया था। दो-आयामी द्विध्रुवीय घूर्णी अनुनाद (DARR)76 और रेडियो फ्रीक्वेंसी रीकनेक्शन (RFDR)77 स्पेक्ट्रा क्रमशः 12.5 kHz और 20 kHz की MAS आवृत्तियों पर प्राप्त किए गए थे।1H से 13C तक क्रॉस ध्रुवीकरण (CP) 1H पर 60.0 से 48.0 kHz, 13C पर 61.3/71.6 kHz (12.5/20 kHz MAS पर) और संपर्क समय 0.5-1 एमएस का उपयोग करके किया गया था।डेटा संग्रह के दौरान 73.5 kHz पर स्पाइनल6478 डिकॉउलिंग का उपयोग किया गया था।अधिग्रहण का समय 10 मिलीसेकंड था और चक्र विलंब 2.5 सेकंड था।आरएफडीआर स्पेक्ट्रा में देखे गए एकल-लिंक्ड Cα/Cβ सहसंबंधों को डीएआरआर स्पेक्ट्रा में विशिष्ट अवशेष-प्रकार के रासायनिक बदलावों और बहु-लिंक्ड सहसंबंधों के आधार पर सौंपा गया था।
Zipper79 डेटाबेस (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) का उपयोग NT, NTFlSp और NTMiSp के लिए स्पंदन प्रवृत्तियों और रोसेटा ऊर्जा का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था।जिपर डेटाबेस रोसेटा एनर्जी80 की गणना करता है, जो प्रोटीन संरचना को मॉडल और विश्लेषण करने के लिए कई मुफ्त ऊर्जा कार्यों को जोड़ता है।-23 किलो कैलोरी/मोल या उससे कम का ऊर्जा स्तर फाइब्रिलेट करने की उच्च प्रवृत्ति को इंगित करता है।कम ऊर्जा का अर्थ है ज़िपर संरचना में दो β-स्ट्रैंड की अधिक स्थिरता।इसके अलावा, वाल्ट्ज एल्गोरिथ्म का उपयोग NT, NTFlSp और NTMiSp Ref में अमाइलॉइडोजेनिक क्षेत्रों की भविष्यवाणी करने के लिए किया गया था।81. (https://waltz.switchlab.org/)।
पीएच को क्रमशः पीएच 6 और 7 तक कम करने के लिए एनटी प्रोटीन समाधान को पीएच 5.5 और 6.0 पर 2-(एन-मॉर्फोलिनो) एथेनसल्फोनिक एसिड (एमईएस) बफर के साथ मिलाया गया था।अंतिम प्रोटीन सांद्रता 100 मिलीग्राम/मिलीलीटर थी।
माप 0.1 सेमी के ऑप्टिकल पथ के साथ 300 μL क्युवेट का उपयोग करके जे-1500 सीडी स्पेक्ट्रोमीटर (जेएएससीओ, यूएसए) पर किया गया था।प्रोटीन को 20 मिमी फॉस्फेट बफर (पीएच 8) में 10 μM (n = 1) तक पतला किया गया था।नमक की उपस्थिति में प्रोटीन स्थिरता का विश्लेषण करने के लिए, प्रोटीन का विश्लेषण क्रमशः 154 मिमी NaF या NaCl युक्त 20 मिमी फॉस्फेट बफर (पीएच 8) में समान एकाग्रता (एन = 1) पर किया गया था।तापमान स्कैन 222 एनएम पर 25°C से 95°C तक 1°C/मिनट की ताप दर के साथ दर्ज किया गया।मूल रूप से मुड़े हुए प्रोटीन के अनुपात की गणना सूत्र (केडीमाप - केडीफाइनल)/(केडीस्टार्ट - केडीफाइनल) का उपयोग करके की गई थी।इसके अलावा, प्रत्येक नमूने के लिए 260 एनएम से 190 एनएम तक 25 डिग्री सेल्सियस पर और 95 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करने के बाद पांच स्पेक्ट्रा दर्ज किए गए थे।पांच स्पेक्ट्रा का औसत निकाला गया, चिकना किया गया और मोलर अण्डाकारता में परिवर्तित किया गया।प्रिज्म 9 का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण किया गया।
हिज़-एनटी-जीएफपी (300 मिलीग्राम/एमएल, 80 μL) की प्रतिदीप्ति तीव्रता को 96-वेल कॉर्निंग प्लेटों में एक काले पारदर्शी तल (कॉर्निंग ग्लास 3881, यूएसए) के साथ स्थिर परिस्थितियों में तीन प्रतियों (एन = 3) में मापा गया था।395 एनएम की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के साथ एक प्रतिदीप्ति-आधारित प्लेट रीडर के साथ नमूनों को मापें और जेलेशन से पहले 509 एनएम पर और 2 घंटे बाद 37 डिग्री सेल्सियस पर उत्सर्जन रिकॉर्ड करें।डेटा का विश्लेषण प्रिज्म 9 से किया गया।
निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्यूरीन न्यूक्लियोसाइड फॉस्फोरिलेज़ गतिविधि परख किट (फ्लोरोमेट्रिक विधि, सिग्मा एल्ड्रिच) का उपयोग किया गया था।हिस-एनटी-पीएनपी युक्त जैल और समाधानों में गतिविधि को मापने के लिए, हिस-एनटी-पीएनपी के 10 एनजी को 100 मिलीग्राम/एमएल एनटी के साथ 2 μL की कुल मात्रा में मिलाएं क्योंकि जेल ने सेट के डिटेक्शन अंतराल के ऊपर एक संकेत दिया था।His-NT-PNP के बिना जैल और समाधानों के नियंत्रण शामिल किए गए थे।माप दो बार किए गए (n = 2)।गतिविधि को मापने के बाद, प्रतिक्रिया मिश्रण को हटा दिया गया और यह सुनिश्चित करने के लिए जेल की तस्वीर खींची गई कि माप के दौरान जेल बरकरार रहे।प्रिज्म 9 का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण किया गया।
अध्ययन डिज़ाइन के बारे में अधिक जानकारी के लिए, इस लेख से जुड़ा प्रकृति अध्ययन सार देखें।
चित्र 1 और 2 प्रारंभिक डेटा प्रस्तुत करते हैं।1सी, 2ए-सी, 3ए, बी, ई-जी, 4, 5बी, डी, एफ, और 6, अनुपूरक चित्र।3, अनुपूरक चित्र.5ए, डी, अनुपूरक चित्र।6 और अनुपूरक चित्र.8. डेटा इस अध्ययन का डेटा ज़ेनोडो डेटाबेस https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653 में होस्ट किया गया है।इस अध्ययन में प्राप्त एनएमआर डेटा को प्रविष्टि आईडी bmrbig36 के तहत BMRBig रिपॉजिटरी में पोस्ट किया गया था।जीएफपी और पीएनपी की संरचनाएं पीडीबी (जीएफपी 2बी3क्यू, पीएनपी 4आरजे2) से ली गई थीं।
राइजिंग, ए. और जोहानसन, जे. कृत्रिम मकड़ी रेशम की कताई।राष्ट्रीय रसायन.जीव विज्ञान.11, 309-315 (2015)।
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