347 12.7*1.24 मिमी स्टेनलेस स्टील कुंडलित टयूबिंग, तुल्यकालिक इलेक्ट्रोस्टैटिक संघनन और α-सिन्यूक्लिन और ताऊ के एकत्रीकरण का आणविक तंत्र

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347 स्टेनलेस स्टील पाइप विशिष्टता

347 12.7*1.24 मिमी स्टेनलेस स्टील कुंडलित ट्यूबिंग

बाहरी व्यास: 6.00 मिमी ओडी से 914.4 मिमी ओडी तक, आकार 24" एनबी तक उपलब्ध पूर्व-स्टॉक, ओडी आकार स्टील ट्यूब उपलब्ध पूर्व-स्टॉक

एसएस 347 पाइप मोटाई रेंज: 0.3 मिमी - 50 मिमी, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, आदि (0.5-12 मिमी) या आवश्यकतानुसार गैर-नियमित आकार

प्रकार: एसएस 347 सीमलेस पाइप्स |एसएस 347 ईआरडब्ल्यू पाइप्स |एसएस 347 वेल्डेड पाइप्स |एसएस 347 फैब्रिकेटेड पाइप्स |एसएस 347 सीडीडब्ल्यू ट्यूब, एलएसएडब्ल्यू पाइप्स/सीम-वेल्डेड/फिर से खींचा गया

प्रपत्र: एसएस 347 गोल पाइप/ट्यूब, एसएस 347 वर्गाकार पाइप/ट्यूब, एसएस 347 आयताकार पाइप/ट्यूब, एसएस 347 कुंडलित ट्यूब, एसएस 347 "यू" आकार, एसएस 347 पैन केक कॉइल, एसएस 347 हाइड्रोलिक ट्यूब

लंबाई: सिंगल रैंडम, डबल रैंडम और आवश्यक लंबाई अंत: सादा अंत, बेवेल्ड अंत, ट्रेडेड

अंतिम सुरक्षा: प्लास्टिक कैप्स |बाहरी फिनिश: स्टेनलेस स्टील पाइप के लिए 2बी, नंबर 4, नंबर 1, नंबर 8 मिरर फिनिश, ग्राहकों की आवश्यकताओं के अनुसार फिनिश

डिलिवरी की स्थिति: एनील्ड और पिकल्ड, पॉलिश, ब्राइट एनील्ड, कोल्ड ड्रिंक

निरीक्षण, परीक्षण रिपोर्ट: मिल परीक्षण प्रमाणपत्र, ईएन 10204 3.1, रासायनिक रिपोर्ट, यांत्रिक रिपोर्ट, पीएमआई परीक्षण रिपोर्ट, दृश्य निरीक्षण रिपोर्ट, तृतीय पक्ष निरीक्षण रिपोर्ट, एनएबीएल अनुमोदित लैब रिपोर्ट, विनाशकारी परीक्षण रिपोर्ट, गैर विनाशकारी परीक्षण रिपोर्ट

पैकिंग: लकड़ी के बक्से, प्लास्टिक बैग, स्टील स्ट्रिप्स बंडल, या ग्राहकों के अनुरोध के अनुसार पैक किया गया

विशेष: उपरोक्त के अलावा अन्य आकार और विशिष्टताओं का निर्माण अनुरोध पर किया जा सकता है

एसएस 347 पाइप आकार सीमा: 1/2 इंच एनबी, ओडी से 24 इंच

एएसटीएम ए312 347: उच्च तापमान और सामान्य संक्षारक सेवा के लिए निर्बाध और सीधी-सीम वेल्डेड ऑस्टेनिटिक पाइप।वेल्डिंग के दौरान फिलर धातु की अनुमति नहीं है।

एएसटीएम ए358 347: संक्षारक और/या उच्च तापमान सेवा के लिए इलेक्ट्रिक फ्यूजन वेल्डेड ऑस्टेनिटिक पाइप।आमतौर पर इस विनिर्देश के अनुसार केवल 8 इंच तक के पाइप का उत्पादन किया जाता है।वेल्डिंग के दौरान भराव धातु जोड़ने की अनुमति है।

एएसटीएम ए790 347: सामान्य संक्षारक सेवा के लिए सीमलेस और स्ट्रेट-सीम वेल्डेड फेरिटिक/ऑस्टेनिटिक (डुप्लेक्स) पाइप, तनाव संक्षारण क्रैकिंग के प्रतिरोध पर विशेष जोर देने के साथ।

एएसटीएम ए409 347: सीधे-सीम या सर्पिल-सीम ​​इलेक्ट्रिक फ्यूजन वेल्डेड बड़े व्यास ऑस्टेनिटिक लाइट-दीवार पाइप 14" से 30" आकार में संक्षारक और/या उच्च के लिए एसएच5एस और एसएच 10एस दीवारों के साथ

एएसटीएम ए376 347: उच्च तापमान अनुप्रयोगों के लिए निर्बाध ऑस्टेनिटिक पाइप।

एएसटीएम ए813 347: उच्च तापमान और सामान्य संक्षारक अनुप्रयोगों के लिए सिंगल-सीम, सिंगल- या डबल-वेल्डेड ऑस्टेनिटिक पाइप।

एएसटीएम ए814 347: उच्च तापमान और सामान्य संक्षारक सेवा के लिए कोल्ड-वर्क्ड वेल्डेड ऑस्टेनिटिक पाइप।

347H स्टेनलेस स्टील पाइप रासायनिक संरचना

स्टेनलेस स्टील 347एच पाइप यांत्रिक गुण

स्टेनलेस स्टील 347एच पाइप्स भौतिक गुण

347H स्टेनलेस स्टील पाइप के लिए समतुल्य ग्रेड

अमाइलॉइड अल्फा-सिन्यूक्लिन (αS) एकत्रीकरण पार्किंसंस रोग और अन्य सिन्यूक्लिओपैथियों की पहचान है।हाल ही में, आमतौर पर अल्जाइमर रोग से जुड़े ताऊ प्रोटीन को αS विकृति विज्ञान के साथ जोड़ा गया है और αS-समृद्ध समावेशन में सह-स्थानीयकृत पाया गया है, हालांकि दो प्रोटीनों के एकत्रीकरण का आणविक तंत्र अस्पष्ट बना हुआ है।हम यहां रिपोर्ट करते हैं कि αS चरण ताऊ जैसे सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए पॉलीपेप्टाइड्स के साथ इलेक्ट्रोस्टैटिक जटिल संक्षेपण के माध्यम से तरल संघनन में अलग हो जाता है।पॉलीकेशन के लिए αS की आत्मीयता और जमावट नेटवर्क की वैलेंस कमी की दर के आधार पर, थक्के तेजी से जमाव या सहसंयोजन से गुजरते हैं और इसके बाद धीमी गति से एमाइलॉइड एकत्रीकरण होता है।उन्नत बायोफिजिकल तकनीकों के संयोजन से, हम तरल-तरल αS/ताऊ चरण पृथक्करण को चिह्नित करने और उन प्रमुख कारकों की पहचान करने में सक्षम थे जो तरल प्रोटीन कंडेनसेट में दोनों प्रोटीन युक्त विषम समुच्चय के गठन का कारण बनते हैं।
झिल्ली डिब्बों के अलावा, तरल-तरल चरण पृथक्करण (एलएलपीएस) नामक प्रक्रिया के माध्यम से, कोशिकाओं में स्थानिक पृथक्करण प्रोटीन युक्त, तरल जैसे घने निकायों के गठन से भी प्राप्त किया जा सकता है, जिन्हें बायोमोलेक्यूलर कंडेनसेट या बूंदें कहा जाता है।ये बूंदें आमतौर पर प्रोटीन या प्रोटीन और आरएनए के बीच बहुसंयोजक अस्थायी इंटरैक्शन से बनती हैं, और लगभग सभी जीवित प्रणालियों में विभिन्न प्रकार के कार्य करती हैं।बड़ी संख्या में एलएलपी-सक्षम प्रोटीन कम जटिलता के अनुक्रम प्रदर्शित करते हैं जो प्रकृति में और बायोमोलेक्यूलर कंडेनसेट 3,4,5 के निर्माण में अत्यधिक अव्यवस्थित होते हैं।कई प्रयोगात्मक अध्ययनों से प्रोटीन की लचीली, अक्सर अव्यवस्थित और बहुसंयोजी प्रकृति का पता चला है जो इन तरल जैसे संघनन को बनाते हैं, हालांकि उन विशिष्ट आणविक निर्धारकों के बारे में बहुत कम जानकारी है जो इन संघनन के विकास और परिपक्वता को अधिक ठोस रूप में नियंत्रित करते हैं। राज्य।.
नया डेटा इस परिकल्पना का समर्थन करता है कि असामान्य प्रोटीन-संचालित एलएलपीएस और बूंदों का ठोस संरचनाओं में परिवर्तन अघुलनशील विषाक्त समुच्चय के गठन के लिए प्रासंगिक सेलुलर मार्ग हो सकते हैं जो अक्सर अपक्षयी रोगों के लक्षण होते हैं।कई एलएलपीएस-संबंधित आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन (आईडीपी), जो अक्सर अत्यधिक चार्ज और लचीले होते हैं, लंबे समय से एमाइलॉइड एकत्रीकरण की प्रक्रिया के माध्यम से न्यूरोडीजेनेरेशन से जुड़े हुए हैं।विशेष रूप से, FUS7 या TDP-438 जैसे बायोमोलेक्यूलर IDP संघनित या hnRNPA19 जैसे बड़े कम जटिलता डोमेन वाले प्रोटीन को द्रवीकरण नामक प्रक्रिया के माध्यम से जेल जैसे या यहां तक ​​कि ठोस रूपों में उम्र बढ़ने के लिए दिखाया गया है।मिश्रण।ठोस चरण संक्रमण (एलएसपीटी) को समय के एक कार्य के रूप में या कुछ पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों या पैथोलॉजिकल रूप से महत्वपूर्ण उत्परिवर्तन 1,7 के जवाब में।
विवो में एलएलपीएस से जुड़ा एक अन्य आईडीपी ताऊ है, एक सूक्ष्मनलिका-संबंधित अव्यवस्थित प्रोटीन जिसका अमाइलॉइड एकत्रीकरण अल्जाइमर रोग10 में शामिल किया गया है, लेकिन हाल ही में पार्किंसंस रोग (पीडी) में भी शामिल किया गया है और अन्य सिनैप्टिक परमाणु प्रोटीनोपैथी 11, 12, 13 संबंधित हैं।यह देखा गया है कि अनुकूल इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन14 के कारण ताऊ स्वतः ही समाधान/साइटोप्लाज्म से अलग हो जाता है, जिसके परिणामस्वरूप ताऊ-समृद्ध बूंदों का निर्माण होता है जिन्हें इलेक्ट्रोस्टैटिक कोएसर्वेट्स के रूप में जाना जाता है।यह भी देखा गया है कि इस प्रकार की गैर-विशिष्ट अंतःक्रिया प्रकृति में कई जैव-आणविक संघनन के पीछे प्रेरक शक्ति है15।टाऊ प्रोटीन के मामले में, इलेक्ट्रोस्टैटिक एकत्रीकरण सरल एकत्रीकरण द्वारा बनाया जा सकता है, जिसमें प्रोटीन के विपरीत रूप से चार्ज किए गए क्षेत्र दरार प्रक्रिया को ट्रिगर करते हैं, या आरएनए जैसे नकारात्मक चार्ज पॉलिमर के साथ बातचीत के माध्यम से जटिल एकत्रीकरण द्वारा।
हाल ही में, α-सिन्यूक्लिन (αS), पीडी और अन्य न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों में शामिल एक अमाइलॉइड आईडीपी, जिसे सामूहिक रूप से सिन्यूक्लिनोपैथी17,18 के रूप में जाना जाता है, को सेलुलर और पशु मॉडल19,20 में तरल पदार्थ जैसे व्यवहार के साथ प्रोटीन संघनन में प्रदर्शित किया गया है।इन विट्रो अध्ययनों से पता चला है कि αS मुख्य रूप से हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन के माध्यम से सरल एकत्रीकरण द्वारा एलएलपीएस से गुजरता है, हालांकि इस प्रक्रिया के लिए असाधारण रूप से उच्च प्रोटीन सांद्रता और असामान्य रूप से लंबे ऊष्मायन समय की आवश्यकता होती है।क्या विवो में देखे गए αS युक्त कंडेनसेट इस या अन्य एलएलपीएस प्रक्रियाओं द्वारा बनते हैं, यह एक प्रमुख अनसुलझा मुद्दा बना हुआ है।इसी तरह, हालांकि पीडी और अन्य सिन्यूक्लिनोपैथियों में न्यूरॉन्स में αS अमाइलॉइड एकत्रीकरण देखा गया है, सटीक तंत्र जिसके द्वारा αS इंट्रासेल्युलर अमाइलॉइड एकत्रीकरण से गुजरता है, अस्पष्ट रहता है, क्योंकि इस प्रोटीन की अधिक अभिव्यक्ति इस प्रक्रिया को अपने आप ट्रिगर नहीं करती है।अतिरिक्त सेलुलर क्षति की अक्सर आवश्यकता होती है, यह सुझाव देते हुए कि इंट्रासेल्युलर αS अमाइलॉइड असेंबलियों के पुनर्चक्रण के लिए कुछ सेलुलर स्थानों या सूक्ष्म वातावरण की आवश्यकता होती है।एक सेलुलर वातावरण जो विशेष रूप से एकत्रीकरण के लिए प्रवण होता है वह प्रोटीन संघनन 23 का आंतरिक भाग हो सकता है।
दिलचस्प बात यह है कि αS और tau को पार्किंसंस रोग और अन्य सिन्यूक्लिनोपैथियों 24,25 के साथ मनुष्यों में विशिष्ट रोग समावेशन में सह-स्थानीयकृत पाया गया है और प्रयोगों ने दो प्रोटीन 26,27 के बीच एक सहक्रियात्मक रोग संबंधी संबंध की सूचना दी है, जो एकत्रीकरण αS और के बीच एक संभावित संबंध का सुझाव देता है। न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में ताऊ।बीमारी।αS और tau को इन विट्रो और विवो 28,29 में एक-दूसरे के एकत्रीकरण को बढ़ावा देने और बातचीत करने के लिए पाया गया है और इन दो प्रोटीनों से बने विषम समुच्चय को सिन्यूक्लिनोपैथिस 30 वाले रोगियों के मस्तिष्क में देखा गया है।हालाँकि, αS और tau के बीच परस्पर क्रिया के आणविक आधार और इसके सह-एकत्रीकरण के तंत्र के बारे में बहुत कम जानकारी है।αS को αS के अत्यधिक नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए सी-टर्मिनल क्षेत्र और ताऊ के केंद्रीय प्रोलाइन-समृद्ध क्षेत्र के बीच एक इलेक्ट्रोस्टैटिक आकर्षण के माध्यम से ताऊ के साथ बातचीत करने की सूचना मिली है, जो सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए अवशेषों में भी समृद्ध है।
इस अध्ययन में, हम दिखाते हैं कि αS वास्तव में ताऊ प्रोटीन की उपस्थिति में इलेक्ट्रोस्टैटिक जटिल संघनन के माध्यम से बूंदों में अलग हो सकता है, जो कि पॉली-एल-लाइसिन (पीएलके) जैसे अन्य सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए पॉलीपेप्टाइड्स के साथ इसकी बातचीत के विपरीत है, और इस प्रक्रिया में।αS बूंद नेटवर्क के लिए एक मचान अणु के रूप में कार्य करता है।हमने इलेक्ट्रोस्टैटिक αS कोएसर्वेट की परिपक्वता की प्रक्रिया में ध्यान देने योग्य अंतर की पहचान की है, जो कोएसर्वेट नेटवर्क में शामिल प्रोटीन की परस्पर क्रिया की वैधता और ताकत में अंतर से जुड़े हैं।दिलचस्प बात यह है कि हमने लंबे समय तक जीवित रहने वाले तरल कोएसर्वेट्स में αS और ताऊ अमाइलॉइड प्रोटीन के सह-एकत्रीकरण को देखा और कुछ प्रमुख कारकों की पहचान की, जो ऐसे कोएसर्वेट्स में इन दो प्रोटीनों के सह-एकत्रीकरण का कारण बनते हैं।यहां हम इस प्रक्रिया का विस्तार से वर्णन करते हैं, जो रोग-विशिष्ट समावेशन में दो प्रोटीनों के सहस्थानीकरण में अंतर्निहित एक संभावित आणविक तंत्र है।
αS में तटस्थ पीएच (छवि 1 ए) पर एक अत्यधिक आयनिक सी-टर्मिनल पूंछ होती है, और हमने परिकल्पना की है कि यह पॉलीकेशनिक अव्यवस्थित पॉलीपेप्टाइड अणुओं के साथ इलेक्ट्रोस्टैटिक परिसरों के संघनन के माध्यम से एलएलपीएस से गुजर सकता है।हमने प्रारंभिक मॉडल अणु के रूप में 100-अवशेष पॉली-एल-लाइसिन (पीएलके) का उपयोग तटस्थ पीएच 32 पर सकारात्मक रूप से चार्ज और अव्यवस्थित बहुलक प्रकृति के कारण किया। सबसे पहले, हमने पुष्टि की कि पीएलके समाधान एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी के माध्यम से αS के सीटी डोमेन के साथ इंटरैक्ट करता है। (चित्र 1बी) बढ़ते αS:pLK दाढ़ अनुपात की उपस्थिति में 13C/15N-लेबल αS का उपयोग करते हुए।αS के सीटी-डोमेन के साथ पीएलके की परस्पर क्रिया रासायनिक बदलाव की गड़बड़ी और प्रोटीन के इस क्षेत्र में चरम तीव्रता में कमी के रूप में प्रकट होती है।दिलचस्प बात यह है कि जब हमने लगभग αS सांद्रता पर αS को pLK के साथ मिलाया।पॉलीइथाइलीन ग्लाइकोल (5-15% पीईजी-8) (सामान्य एलएलपीएस बफर: 10 मिमी एचईपीईएस पीएच 7.4, 100 मिमी NaCl, 15% पीईजी-8) की उपस्थिति में 5-25 µM हम तुरंत प्रोटीन निर्माण के एक विस्तृत क्षेत्र से गुजरे .प्रतिदीप्ति (डब्ल्यूएफ) और उज्ज्वल-क्षेत्र (बीएफ) माइक्रोस्कोपी (छवि 1 सी) का उपयोग करके बूंदों को देखा गया।1-5 µm बूंदों में सांद्र αS (1 µM AlexaFluor488-लेबल αS, AF488-αS जोड़ा गया) युक्त, उनके इलेक्ट्रोस्टैटिक गुणों को उनके 10% 1,6-हेक्सानेडियोल (1,6-HD) के प्रतिरोध और इसकी संवेदनशीलता से प्राप्त किया जा सकता है। NaCl सांद्रता में वृद्धि (चित्र 1c)।αS/pLK इलेक्ट्रोस्टैटिक कॉम्प्लेक्स के सहसंयोजकों की द्रव जैसी प्रकृति को मिलीसेकेंड के भीतर फ़्यूज़ करने की उनकी क्षमता द्वारा प्रदर्शित किया जाता है (चित्र 1d)।टर्बिडिमेट्री का उपयोग करते हुए, हमने इन परिस्थितियों में बूंदों के गठन की मात्रा निर्धारित की, इसकी स्थिरता (छवि 1e) से जुड़ी मुख्य बातचीत की इलेक्ट्रोस्टैटिक प्रकृति की पुष्टि की, और एलएलपीएस प्रक्रिया (छवि 1 एफ) पर विभिन्न बहुलक अनुपातों के प्रभाव का मूल्यांकन किया।हालाँकि, बहुलक अनुपात की एक विस्तृत श्रृंखला में बूंदों का निर्माण देखा जाता है, लेकिन जब pLK αS से अधिक होता है तो यह प्रक्रिया बहुत अनुकूल होती है।एलएलपी को रासायनिक रूप से भिन्न विस्थापन एजेंट डेक्सट्रान-70 (70 केडीए) का उपयोग करते हुए या विभिन्न प्रकार के नमूना प्रारूपों का उपयोग करते हुए भी देखा गया है, जिसमें ग्लास स्लाइड ड्रॉप्स, विभिन्न सामग्रियों के माइक्रोप्लेट कुएं, एपेंडॉर्फ या क्वार्ट्ज केशिकाएं शामिल हैं।
इस अध्ययन में उपयोग किए गए WT-αS और ΔCt-αS वेरिएंट में विभिन्न प्रोटीन क्षेत्रों का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व।एम्फ़िपैथिक एन-टर्मिनल डोमेन, हाइड्रोफोबिक अमाइलॉइड-फॉर्मिंग (एनएसी) क्षेत्र, और नकारात्मक चार्ज सी-टर्मिनल डोमेन क्रमशः नीले, नारंगी और लाल रंग में दिखाए गए हैं।WT-αS का नेट चार्ज प्रति अवशिष्ट (NCPR) मानचित्र दिखाया गया है।मैक्रोमोलेक्यूलर क्लंप की अनुपस्थिति में αS/pLK इंटरैक्शन का बी एनएमआर विश्लेषण।जैसे-जैसे पीएलके सांद्रता बढ़ती है (αS:pLK मोलर अनुपात 1:0.5, 1:1.5 और 1:10 क्रमशः हल्के हरे, हरे और गहरे हरे रंग में दिखाए जाते हैं)।सी एलएलपीएस बफर (ऊपर) में 25 µM (1 µM AF488-लेबल αS या WF इमेजिंग के लिए Atto647N-लेबल pLK) पर αS/pLK (दाढ़ अनुपात 1:10) को कोएसर्वेट करें या 500 mM NaCl (नीचे बाएं) के साथ पूरक या 10 के बाद % 1,6-हेक्सानेडिओल (1,6-एचडी; नीचे दाएं)।स्केल बार = 20 µm.डी 25 μM की सांद्रता पर αS/pLK (मोलर अनुपात 1:10) के बीएफ छोटी बूंद संलयन की प्रतिनिधि सूक्ष्म छवियां;तीर 200 एमएस के भीतर व्यक्तिगत बूंदों (लाल और पीले तीर) को एक नई बूंद (नारंगी तीर) में विलय का संकेत देते हैं।स्केल बार = 20 µm.ई प्रकाश प्रकीर्णन (350 एनएम पर) 25 µM αS पर 500 mM NaCl या 10% 1,6-HD जोड़ने से पहले और बाद में LLPS बफर में αS/pLK एकत्रीकरण (N = 3 नमूना प्रतिकृति, माध्य और मानक विचलन भी दर्शाया गया है)।एफ बीएफ छवि (ऊपर) और αS/pLK एकत्रीकरण का प्रकाश प्रकीर्णन विश्लेषण (350 एनएम, नीचे) 25 μM αS पर बढ़ते αS:pLK दाढ़ अनुपात (एन = 3 नमूना प्रतिकृति, माध्य और मानक विचलन भी इंगित) के साथ।स्केल बार = 10 µm.एक छवि पर स्केल बार एक पैनल में सभी छवियों के पैमाने को इंगित करता है।कच्चा डेटा कच्ची डेटा फ़ाइलों के रूप में प्रदान किया जाता है।
αS/pLK इलेक्ट्रोस्टैटिक जटिल संघनन के हमारे अवलोकनों और tau31 के साथ सीधे संपर्क के माध्यम से tau/RNA संघनन के ग्राहक अणु के रूप में αS के पिछले अवलोकनों के आधार पर, हमने अनुमान लगाया कि αS और tau RNA की अनुपस्थिति में विलायक के साथ सह-पृथक हो सकते हैं। वाष्पीकरण।इलेक्ट्रोस्टैटिक कॉम्प्लेक्स के माध्यम से, और αS, αS/Tau coacervetes में मचान प्रोटीन है (चित्र 2e में tau चार्ज वितरण देखें)।हमने देखा कि जब 10 μM αS और 10 μM Tau441 (क्रमशः 1 μM AF488-αS और 1 μM Atto647N-Tau युक्त) को LLPS बफर में एक साथ मिलाया गया, तो उन्होंने आसानी से दोनों प्रोटीन युक्त प्रोटीन समुच्चय का गठन किया, जैसा कि WF माइक्रोस्कोपी द्वारा देखा गया था।(चित्र 2ए)।बूंदों में दो प्रोटीनों के कोलोकलाइज़ेशन की पुष्टि कन्फोकल (सीएफ) माइक्रोस्कोपी (पूरक छवि 1 ए) द्वारा की गई थी।इसी तरह का व्यवहार तब देखा गया जब डेक्सट्रान-70 को एकत्रीकरण एजेंट के रूप में इस्तेमाल किया गया था (पूरक छवि 1सी)।एफआईटीसी-लेबल वाले पीईजी या डेक्सट्रान का उपयोग करते हुए, हमने पाया कि दोनों क्राउडिंग एजेंटों को नमूनों में समान रूप से वितरित किया गया था, न तो अलगाव और न ही एसोसिएशन (पूरक छवि 1 डी) दिखा।बल्कि, यह सुझाव देता है कि इस प्रणाली में वे मैक्रोमोलेक्यूलर क्राउडिंग प्रभावों के माध्यम से चरण पृथक्करण को बढ़ावा देते हैं, क्योंकि पीईजी एक अधिमान्य रूप से स्थिर क्राउडिंग एजेंट है, जैसा कि अन्य एलएलपी सिस्टम33,34 में देखा जाता है।ये प्रोटीन युक्त बूंदें NaCl (1 M) के प्रति संवेदनशील थीं, लेकिन 1,6-HD (10% v/v) के प्रति नहीं, जो उनके इलेक्ट्रोस्टैटिक गुणों की पुष्टि करता है (पूरक छवि 2 ए, बी)।बीएफ माइक्रोस्कोपी (छवि 2 बी) का उपयोग करके मिलीसेकंड विलय वाली बूंदों की घटनाओं को देखकर उनके द्रव व्यवहार की पुष्टि की गई थी।
एलएलपीएस बफर में αS/Tau441 कोएसर्वेट्स की कन्फोकल (CF) माइक्रोस्कोपी छवियां (प्रत्येक प्रोटीन का 10 μM, AF488-लेबल αS का 0.5 μM और Atto647N-लेबल Tau441)।बी αS/Tau441 छोटी बूंद संलयन घटनाओं (प्रत्येक प्रोटीन के लिए 10 μM) की प्रतिनिधि अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट (DIC) छवियां।सी चरण आरेख 50 µM αS की अनुपस्थिति (बाएं) या उपस्थिति (दाएं) में Tau441 LLPS (0-15 µM) के प्रकाश प्रकीर्णन (350 एनएम पर) पर आधारित है।गर्म रंग अधिक बिखरने का संकेत देते हैं।d बढ़ती αS सांद्रता के साथ αS/Tau441 LLPS नमूनों का प्रकाश प्रकीर्णन (5 µM पर Tau441, N = संकेत के अनुसार 2-3 नमूना दोहराव)।ई इस अध्ययन में उपयोग किए गए कुछ ताऊ प्रोटीन वेरिएंट और प्रोटीन के विभिन्न क्षेत्रों का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व: नकारात्मक रूप से चार्ज किया गया एन-टर्मिनल डोमेन (लाल), प्रोलाइन-रिच क्षेत्र (नीला), माइक्रोट्यूब्यूल-बाइंडिंग डोमेन (एमटीबीडी, नारंगी में हाइलाइट किया गया), और अमाइलॉइड-गठन जोड़ी सर्पिल।फिलामेंट क्षेत्र (पीएचएफ) एमटीबीडी (ग्रे) के भीतर स्थित हैं।Tau441 का नेट चार्ज प्रति अवशेष (एनसीपीआर) मानचित्र दिखाया गया है।f 1 µM AF488-लेबल αS और Atto647N-लेबल ΔNt- का उपयोग करना, ΔNt-Tau (शीर्ष, 10 µM प्रति प्रोटीन) या K18 (नीचे, 50 µM प्रति प्रोटीन) की उपस्थिति में 1 µM AF488-लेबल αS या ΔCt-αS का उपयोग करना। ) ) ) डब्लूएफ के माइक्रोग्राफ एलएलपीएस या के18 बफर में संघनित हुए।एक छवि में स्केल बार एक पैनल में सभी छवियों के पैमाने का प्रतिनिधित्व करते हैं (पैनल ए, बी और एफ के लिए 20 माइक्रोन)।पैनल सी और डी के लिए कच्चा डेटा कच्ची डेटा फ़ाइलों के रूप में प्रदान किया जाता है।
इस एलएलपीएस प्रक्रिया में αS की भूमिका का परीक्षण करने के लिए, हमने सबसे पहले NaCl (छवि 2c) की बढ़ती सांद्रता का उपयोग करके नेफेलोमेट्री द्वारा छोटी बूंद स्थिरता पर αS के प्रभाव की जांच की।αS युक्त नमूनों में नमक की सांद्रता जितनी अधिक होगी, प्रकाश प्रकीर्णन मान उतना ही अधिक होगा (350 एनएम पर), जो इस LLPS प्रणाली में αS की स्थिर भूमिका को इंगित करता है।इसी तरह का प्रभाव αS सांद्रता (और इसलिए αS:Tau441 अनुपात) को लगभग बढ़ाकर देखा जा सकता है।ताऊ सांद्रता (5 µM) के सापेक्ष 10 गुना वृद्धि (चित्र 2डी)।यह प्रदर्शित करने के लिए कि αS कोएसर्वेट्स में एक मचान प्रोटीन है, हमने एलएलपीएस-बाधित ताऊ उत्परिवर्ती के व्यवहार की जांच करने का निर्णय लिया, जिसमें नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए एन-टर्मिनल क्षेत्र (अवशेष 1-150, चित्र 2ई देखें) का अभाव है, जिसे ΔNt-Tau कहा जाता है।डब्ल्यूएफ माइक्रोस्कोपी और नेफेलोमेट्री ने पुष्टि की कि ΔNt-Tau स्वयं एलएलपीएस (छवि 2 एफ और अनुपूरक छवि 2 डी) से नहीं गुजरा, जैसा कि पहले बताया गया था 14. हालांकि, जब αS को इस काटे गए ताऊ संस्करण के फैलाव समाधान में जोड़ा गया था, तो एलएलपीएस प्रक्रिया पूरी तरह से समाप्त हो गई थी समान परिस्थितियों और प्रोटीन सांद्रता के तहत ताऊ और αS के पूर्ण आकार के समाधानों की बूंद घनत्व के करीब छोटी बूंद घनत्व के साथ बहाल किया गया।इस प्रक्रिया को कम मैक्रोमोलेक्यूलर भीड़ (पूरक छवि 2 सी) की स्थितियों में भी देखा जा सकता है।एलएलपीएस प्रक्रिया में सी-टर्मिनल αS क्षेत्र की भूमिका, लेकिन इसकी पूरी लंबाई नहीं, सी-टर्मिनल काटे गए αS वेरिएंट का उपयोग करके छोटी बूंद के गठन को रोककर प्रदर्शित की गई थी, जिसमें (ΔCt-) के अवशेष 104-140 (छवि 1 ए) की कमी थी। αS) प्रोटीन (चित्र 2f और अनुपूरक चित्र 2d)।αS और ΔNt-Tau के सहस्थानीकरण की पुष्टि कन्फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (पूरक छवि 1 बी) द्वारा की गई थी।
Tau441 और αS के बीच LLPS तंत्र का और अधिक परीक्षण करने के लिए, एक अतिरिक्त Tau वैरिएंट का उपयोग किया गया था, अर्थात् माइक्रोट्यूब्यूल-बाइंडिंग डोमेन (MTBD) में युग्मित हेलिकल फिलामेंट कोर (PHF) टुकड़ा, जिसमें यदि चार विशिष्ट दोहराव डोमेन होते हैं, जिन्हें आमतौर पर भी जाना जाता है K18 टुकड़े के रूप में (चित्र 2e देखें)।हाल ही में यह बताया गया है कि αS अधिमानतः प्रोलाइन-समृद्ध डोमेन में स्थित एक ताऊ प्रोटीन को एक अनुक्रम में बांधता है जो सूक्ष्मनलिका-बाध्यकारी डोमेन से पहले होता है।हालाँकि, PHF क्षेत्र धनात्मक रूप से आवेशित अवशेषों (चित्र 2e देखें), विशेष रूप से लाइसिन (15% अवशेष) से ​​भी समृद्ध है, जिसने हमें यह परीक्षण करने के लिए प्रेरित किया कि क्या यह क्षेत्र αS/Tau कॉम्प्लेक्स के संघनन में भी योगदान देता है।हमने देखा कि K18 अकेले परीक्षण की गई स्थितियों (15% पीईजी या 20% डेक्सट्रान के साथ एलएलपीएस बफर) के तहत 100 μM तक की सांद्रता पर एलएलपीएस को ट्रिगर नहीं कर सका (चित्र 2एफ)।हालाँकि, जब हमने 50 µM αS को 50 µM K18 में जोड़ा, तो K18 और αS युक्त प्रोटीन बूंदों का तेजी से गठन नेफेलोमेट्री (पूरक चित्र 2डी) और डब्ल्यूएफ माइक्रोस्कोपी (चित्र 2एफ) द्वारा देखा गया।जैसा कि अपेक्षित था, ΔCt-αS K18 के LLPS व्यवहार को पुनर्स्थापित करने में असमर्थ था (चित्र 2f)।हम ध्यान दें कि αS/K18 एकत्रीकरण के लिए αS/ΔNt-Tau या αS/Tau441 की तुलना में LLPS को प्रेरित करने के लिए थोड़ी अधिक प्रोटीन सांद्रता की आवश्यकता होती है, अन्य चीजें समान होती हैं।यह माइक्रोट्यूब्यूल-बाइंडिंग डोमेन की तुलना में प्रोलाइन-समृद्ध ताऊ डोमेन के साथ αS सी-टर्मिनल क्षेत्र की मजबूत बातचीत के अनुरूप है, जैसा कि पहले 31 में वर्णित है।
यह देखते हुए कि ΔNt-Tau, αS की अनुपस्थिति में LLPS का प्रदर्शन नहीं कर सकता है, हमने पूर्ण-लंबाई Tau (आइसोटाइप, Tau441/Tau441) के साथ LLPS सिस्टम में इसकी सादगी को देखते हुए αS/Tau LLPS को चिह्नित करने के लिए एक मॉडल के रूप में इस Tau संस्करण को चुना।जटिल (हेटरोटाइपिक, αS/Tau441) एकत्रीकरण प्रक्रियाओं के साथ।हमने सेंट्रीफ्यूजेशन और बिखरे हुए चरण एसडीएस-पेज विश्लेषण (2e देखें) द्वारा αS/Tau और αS/ΔNt-Tau सिस्टम में αS एकत्रीकरण की डिग्री (संघनित चरण प्रोटीन, fαS,c के भाग के रूप में) की तुलना की, बहुत समान मान पाए गए सभी प्रोटीनों के लिए समान सांद्रता पर।विशेष रूप से, हमने αS/Tau और αS/ΔNt-Tau के लिए क्रमशः fαS,c 84 ± 2% और 79 ± 7% प्राप्त किया, जिससे पता चलता है कि αS और tau के बीच हेटरोटाइपिक इंटरैक्शन, tau अणुओं के बीच की बातचीत से बेहतर है।बीच में।
विभिन्न पॉलीकेशन के साथ बातचीत और αS कैनेटीक्स पर संक्षेपण प्रक्रिया के प्रभाव का अध्ययन सबसे पहले फोटोब्लीचिंग (एफआरएपी) विधि के बाद प्रतिदीप्ति रिकवरी द्वारा किया गया था।हमने αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau और αS/pLK कोएसर्वेट्स (100 μM αS को 2 μM αS AF488-αS और 100 μM Tau441 या ΔNt-Tau या 1 mM pLK के साथ पूरक) का परीक्षण किया।नमूना घटकों को मिलाने के बाद पहले 30 मिनट के भीतर डेटा प्राप्त किया गया।प्रतिनिधि FRAP छवियों (छवि 3 ए, αS / Tau441 संघनन) और उनके संबंधित समय पाठ्यक्रम वक्र (छवि 3 बी, अनुपूरक चित्र 3) से, यह देखा जा सकता है कि αS कैनेटीक्स Tau441 कोएसर्वेट्स के समान हैं।और ΔNt-Tau, जो pLK के साथ बहुत तेज़ है।FRAP के अनुसार कोएसर्वेट के अंदर αS के लिए परिकलित प्रसार गुणांक (जैसा कि कांग एट अल. 35 द्वारा वर्णित है) D = 0.013 ± 0.009 µm2/s और D = 0.026 ± 0.008 µm2/s αS/Tau441 और αS/ΔNt- के लिए हैं। αS/ प्रणाली।पीएलके, ताउ, और डी = 0.18 ± 0.04 µm2/s, क्रमशः (चित्र 3सी)।हालाँकि, बिखरे हुए चरण में प्रसार गुणांक αS सभी संघनित चरणों की तुलना में अधिक परिमाण के कई आदेश हैं, जैसा कि समान परिस्थितियों (एलएलपीएस बफर) के तहत प्रतिदीप्ति सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफसीएस, अनुपूरक चित्र 3 देखें) द्वारा निर्धारित किया गया है, लेकिन पॉलीकेशन की अनुपस्थिति में (डी = 8 ± 4 µm2/s)।इसलिए, स्पष्ट आणविक भीड़ प्रभाव के कारण बिखरे हुए चरण में प्रोटीन की तुलना में αS अनुवाद की गतिशीलता कोएसर्वेट्स में काफी कम हो जाती है, हालांकि सभी कोएसर्वेट्स ताऊ चरण के विपरीत, अपने गठन के बाद पहले आधे घंटे के दौरान तरल जैसे गुणों को बरकरार रखते हैं।पीएलके कंडेनसेट में तेज़ गतिकी।
इलेक्ट्रोस्टैटिक कोएसर्वेट्स में αS गतिशीलता (2% AF488-लेबल αS) का a-c FRAP विश्लेषण।तीन प्रतियों में αS/Tau441 FRAP परख की प्रतिनिधि छवियां (ए) में दिखाई गई हैं, जहां लाल घेरे रंगहीन क्षेत्रों को दर्शाते हैं।स्केल बार 5 µm है.बी औसत एफआरएपी वक्र और (सी) 100 µM αS और Tau441 (लाल) या ΔNt-Tau (नीला) या pLK (हरा) के विषुव सांद्रता का उपयोग करके तीन प्रयोगों से 5-6 (एन) अलग-अलग बूंदों के लिए प्रसार गुणांक (डी) की गणना की गई। एलएलपीएस की सांद्रता के दस गुना पर।FRAP वक्र का मानक विचलन छायांकित रंग में दिखाया गया है।तुलना के लिए, बिखरे हुए चरण में प्रसार गुणांक αS को प्रतिदीप्ति सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफसीएस) का उपयोग करके तीन प्रतियों में निर्धारित किया गया था (अधिक जानकारी के लिए पूरक चित्र 3 और विधियाँ देखें)।डी बिना किसी पॉलीकेशन (काला) के या 100 μM Tau441 (लाल) या ΔNt-Tau (नीला) या 1 mM pLK (हरा) की उपस्थिति में LLPS बफर में 100 μM TEMPOL-122-αS का निरंतर एक्स-बैंड ईपीआर स्पेक्ट्रा।इनसेट मजबूत क्षेत्र रेखाओं का एक विस्तृत दृश्य दिखाता है जहां सबसे नाटकीय परिवर्तन होते हैं।ई एलएलपीएस (कोई पीईजी) की अनुपस्थिति में विभिन्न पॉलीकेशन के साथ 50 μM टेम्पोल-122-αS के बाइंडिंग वक्र।सामान्यीकृत ईपीआर स्पेक्ट्रम के बैंड II (IIII/III) की तुलना में बैंड III का कम आयाम Tau441 (लाल), ΔNt-Tau (नीला) और pLK (हरा) के दाढ़ अनुपात को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है।प्रत्येक वक्र पर n समान और स्वतंत्र बाइंडिंग साइटों के साथ एक रफ बाइंडिंग मॉडल का उपयोग करके रंगीन रेखाएं डेटा के लिए उपयुक्त दिखाई देती हैं।कच्चा डेटा कच्ची डेटा फ़ाइलों के रूप में प्रदान किया जाता है।
पूरक के रूप में, हमने निर्देशित स्पिन लेबलिंग (एसडीएसएल) और निरंतर इलेक्ट्रॉन पैरामैग्नेटिक अनुनाद (सीडब्ल्यू-ईपीआर) का उपयोग करके विभिन्न कोएसर्वेट्स में αS की गतिशीलता की जांच की।यथार्थवादी अवशिष्ट रिज़ॉल्यूशन36,37,38 के साथ आईडीपी के लचीलेपन और गतिशीलता की रिपोर्ट करने में यह विधि बहुत उपयोगी साबित हुई है।इस प्रयोजन के लिए, हमने एकल Cys म्यूटेंट में सिस्टीन अवशेषों का निर्माण किया और 4-हाइड्रॉक्सी-2,2,6,6-टेट्रामिथाइलपाइपरिडीन-एन-ऑक्सिल (TEMPOL) स्पिन जांच का उपयोग किया।मालेमाइड डेरिवेटिव उन्हें लेबल करते हैं।अधिक विशेष रूप से, हमने TEMPOL जांच को 122 या 24 αS (TEMPOL-122-αS और TEMPOL-24-αS) स्थिति में डाला।पहले मामले में, हम प्रोटीन के सी-टर्मिनल क्षेत्र को लक्षित करते हैं, जो पॉलीकेशन के साथ बातचीत में शामिल होता है।इसके बजाय, स्थिति 24 हमें कंडेनसेट में प्रोटीन की समग्र गतिशीलता के बारे में जानकारी दे सकती है।दोनों ही मामलों में, बिखरे हुए चरण के प्रोटीन के लिए प्राप्त ईपीआर सिग्नल तेजी से बढ़ने वाली अवस्था में नाइट्रॉक्साइड रेडिकल्स के अनुरूप थे।ताऊ या पीएलके (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 या ΔNt-Tau 1:1 के अनुपात पर या pLK 1:10 के अनुपात पर) की उपस्थिति में चरण पृथक्करण के बाद, सापेक्ष चरम तीव्रता में वृद्धि देखी गई αS का EPR स्पेक्ट्रम।हानि रेखा चौड़ी हो गई, जो तनु चरण में प्रोटीन की तुलना में बूंदों में कम αS पुनर्अभिविन्यास गतिकी का संकेत देती है (चित्र 3डी, अनुपूरक चित्र 4ए)।ये परिवर्तन स्थिति 122 पर अधिक स्पष्ट हैं। जबकि स्थिति 24 पर पीएलके की उपस्थिति ने जांच की गतिशीलता को प्रभावित नहीं किया, स्थिति 122 पर वर्णक्रमीय रेखा का आकार महत्वपूर्ण रूप से बदल गया (पूरक छवि 4 ए)।जब हमने आमतौर पर स्पिन-लेबल IDP38,39 की गतिशीलता का वर्णन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले आइसोट्रोपिक मॉडल (पूरक चित्रा 5 ए) का उपयोग करके दो αS/पॉलीकेशन सिस्टम की स्थिति 122 पर स्पेक्ट्रा को मॉडल करने का प्रयास किया, तो हम प्रयोगात्मक स्पेक्ट्रा का पुनर्निर्माण करने में असमर्थ थे।.24 स्पिन विरोधाभासों की स्थिति का वर्णक्रमीय अनुकरण (पूरक चित्र 5ए)।इससे पता चलता है कि पॉलीकेशन की उपस्थिति में αS के सी-टर्मिनल क्षेत्र के स्पिन कॉन्फ़िगरेशन के स्थान में अधिमान्य स्थान हैं।प्रयोगात्मक ईपीआर स्थितियों के तहत संघनित चरण में αS के अंश पर विचार करते समय (क्रमशः αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau, और αS/pLK के लिए 84 ± 2%, 79 ± 7%, और 47 ± 4%) - पूरक देखें डेटा विश्लेषण सी के चित्र 2ई), यह देखा जा सकता है कि ईपीआर विधि द्वारा पाया गया विस्तार मुख्य रूप से संघनित चरण में विभिन्न पॉलीकेशन के साथ αS के सी-टर्मिनल क्षेत्र की बातचीत को दर्शाता है (TEMPOL-122- का उपयोग करते समय मुख्य परिवर्तन) αS), और प्रोटीन संघनन नहीं।जांच में माइक्रोविस्कोसिटी में वृद्धि देखी गई है।जैसा कि अपेक्षित था, एलएलपीएस के अलावा अन्य स्थितियों में प्रोटीन का ईपीआर स्पेक्ट्रम पूरी तरह से बहाल हो गया था जब मिश्रण में 1 एम NaCl जोड़ा गया था (पूरक छवि 4 बी)।कुल मिलाकर, हमारा डेटा बताता है कि सीडब्ल्यू-ईपीआर द्वारा पता लगाए गए परिवर्तन मुख्य रूप से संघनित चरण में विभिन्न पॉलीकेशन के साथ αS के सी-टर्मिनल क्षेत्र की बातचीत को दर्शाते हैं, और यह बातचीत ताऊ की तुलना में पीएलके के साथ अधिक मजबूत प्रतीत होती है।
कोएसर्वेट में प्रोटीन के बारे में अधिक संरचनात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए, हमने समाधान में एनएमआर का उपयोग करके एलएलपीएस प्रणाली का अध्ययन करने का निर्णय लिया।हालाँकि, हम केवल बिखरे हुए चरण में शेष αS अंश का पता लगा सकते हैं, जो कि एनएमआर विश्लेषण में कोसेर्वेट के अंदर कम प्रोटीन गतिशीलता और समाधान के निचले भाग में घने चरण के कारण हो सकता है।जब हमने एनएमआर (पूरक छवि 5 सी, डी) का उपयोग करके एलएलपीएस नमूने के बिखरे हुए चरण में शेष प्रोटीन की संरचना और गतिशीलता का विश्लेषण किया, तो हमने देखा कि प्रोटीन पीएलके और ΔNt-Tau, दोनों की उपस्थिति में लगभग समान व्यवहार करता है। जो प्रोटीन रीढ़ की हड्डी की माध्यमिक संरचना और गतिशीलता में थे, माध्यमिक रासायनिक बदलाव और R1ρ विश्राम पर प्रयोगों से पता चला।एनएमआर डेटा से पता चलता है कि αS के सी-टर्मिनस को पॉलीकेशन के साथ बातचीत के कारण, प्रोटीन अनुक्रम के बाकी हिस्सों की तरह, अपनी अव्यवस्थित प्रकृति को बनाए रखते हुए गठनात्मक लचीलेपन का महत्वपूर्ण नुकसान होता है।
चूंकि TEMPOL-122-αS संघनित चरण में देखा गया CW-EPR सिग्नल का विस्तार पॉलीकेशन के साथ प्रोटीन की अंतःक्रिया को दर्शाता है, इसलिए हमने LLPS (कोई संचय नहीं) की अनुपस्थिति में विभिन्न पॉलीकेशन के लिए αS की बाइंडिंग आत्मीयता का मूल्यांकन करने के लिए एक EPR अनुमापन किया। बफर एलएलपीएस), यह सुझाव देता है कि पतला और केंद्रित चरणों में इंटरैक्शन समान हैं (जो हमारे डेटा, अनुपूरक चित्र 4 ए और अनुपूरक चित्र 6 द्वारा पुष्टि की गई है)।लक्ष्य यह देखना था कि क्या सभी सहसंयोजक, अपने सामान्य तरल पदार्थ जैसे गुणों के बावजूद, आणविक स्तर पर कोई अंतर्निहित अंतर व्यवहार प्रदर्शित करते हैं।जैसा कि अपेक्षित था, ईपीआर स्पेक्ट्रम पॉलीकेशन एकाग्रता में वृद्धि के साथ व्यापक हो गया, जो लगभग सभी इंटरैक्शन भागीदारों की आणविक बातचीत के कारण आणविक लचीलेपन में कमी को दर्शाता है (चित्र 3ई, अनुपूरक चित्र 6)।pLK ने यह संतृप्ति ΔNt-Tau और Tau441 की तुलना में कम दाढ़ अनुपात (पॉलीकेशन: αS) पर हासिल की।वास्तव में, एन समान और स्वतंत्र बाइंडिंग साइटों को मानते हुए एक अनुमानित बाइंडिंग मॉडल के साथ डेटा की तुलना से पता चला है कि पीएलके (~ 5 μM) का स्पष्ट पृथक्करण स्थिरांक Tau441 या ΔNt-Tau (~ 50 μM) की तुलना में कम परिमाण का एक क्रम है। ).µM).हालाँकि यह एक मोटा अनुमान है, इससे पता चलता है कि αS में निरंतर सकारात्मक चार्ज क्षेत्रों के साथ सरल पॉलीकेशन के लिए उच्च आकर्षण है।αS और विभिन्न पॉलीकेशन के बीच आत्मीयता में इस अंतर को देखते हुए, हमने अनुमान लगाया कि उनके तरल गुण समय के साथ अलग-अलग बदल सकते हैं और इस प्रकार विभिन्न एलएसपीटी प्रक्रियाओं से पीड़ित हो सकते हैं।
प्रोटीन कोएसर्वेट के भीतर अत्यधिक भीड़-भाड़ वाले वातावरण और प्रोटीन की अमाइलॉइड प्रकृति को देखते हुए, हमने संभावित एलएसपीटी प्रक्रियाओं का पता लगाने के लिए समय के साथ कोएसर्वेट के व्यवहार का अवलोकन किया।बीएफ और सीएफ माइक्रोस्कोपी (चित्रा 4) का उपयोग करते हुए, हमने देखा कि αS/Tau441 समाधान में काफी हद तक सहसंबद्ध होता है, जिससे बड़ी बूंदें बनती हैं जो पूरी बूंदों के रूप में कुएं/स्लाइड के तल पर सतह से संपर्क करती हैं और गीली करती हैं, जैसा कि अपेक्षित था (पूरक चित्र) . 7डी);हम नीचे से बनी इन संरचनाओं को "प्रोटीन राफ्ट" कहते हैं।ये संरचनाएं तरल बनी रहीं क्योंकि उन्होंने फ़्यूज़ करने की क्षमता बरकरार रखी (पूरक छवि 7 बी) और एलएलपीएस चालू होने के बाद कई घंटों तक देखा जा सकता था (चित्र 4 और अनुपूरक छवि 7 सी)।हमने देखा कि गीला करने की प्रक्रिया को हाइड्रोफोबिक सामग्री (पूरक छवि 7 ए) के बजाय हाइड्रोफिलिक की सतह पर पसंद किया जाता है, जैसा कि असंतुलित चार्ज और इस प्रकार उच्च इलेक्ट्रोस्टैटिक सतह क्षमता वाले इलेक्ट्रोस्टैटिक कोएसर्वेट्स के लिए अपेक्षित है।उल्लेखनीय रूप से, αS/ΔNt-Tau सहसंयोजन और राफ्टिंग में काफी कमी आई थी, जबकि αS/pLK संघनन में काफी कमी आई थी (चित्र 4)।कम ऊष्मायन समय के दौरान, αS/pLK बूंदें हाइड्रोफिलिक सतह को एकत्रित करने और गीला करने में सक्षम थीं, लेकिन यह प्रक्रिया जल्दी ही बंद हो गई और ऊष्मायन के 5 घंटे के बाद, केवल सीमित सहसंयोजन घटनाएं देखी गईं और कोई गीलापन नहीं देखा गया।- जेल-ड्रिप संक्रमण।
100 µM Tau441 (शीर्ष) प्रतिदीप्ति) सूक्ष्म छवियों की उपस्थिति में LLPS बफर में 100 µM αS (1% फ्लोरोसेंट लेबल) वाले कोएसर्वेट नमूनों के प्रतिनिधि BF (ग्रेस्केल पैनल) और CF (दाएं पैनल, हरे रंग में AF488-लेबल αS) ΔNt -ताऊ (केंद्र) या 1 एमएम पीएलके (नीचे) अलग-अलग ऊष्मायन समय और फोकल ऊंचाई (जेड, प्लेट के नीचे से दूरी) पर।समान परिणामों के साथ प्रयोगों को एक-दूसरे से स्वतंत्र रूप से 4-6 बार दोहराया गया।αS/Tau441 कोएसर्वेट्स 24 घंटों के बाद गीले हो जाते हैं, जिससे छवि से बड़े राफ्ट बनते हैं।सभी छवियों के लिए स्केल बार 20 µm है।
फिर हमने पूछा कि क्या αS/Tau441 LLPS में बनने वाले बड़े तरल पदार्थ जैसे प्रोटीन पूल अध्ययन किए गए किसी भी प्रोटीन के अमाइलॉइड एकत्रीकरण को जन्म देंगे।हमने उपरोक्त शर्तों के तहत डब्ल्यूएफ माइक्रोस्कोपी के साथ समय के साथ αS/Tau441 बूंदों की परिपक्वता का पालन किया, लेकिन 1 μM AF488-लेबल αS और Atto647N-लेबल Tau441 (छवि 5 ए) का उपयोग किया।जैसा कि अपेक्षित था, हमने परिपक्वता प्रक्रिया के दौरान पूर्ण प्रोटीन स्थानीयकरण देखा।दिलचस्प बात यह है कि सीए से.5 घंटों के बाद, राफ्ट के अंदर अधिक तीव्र गैर-गोलाकार संरचनाएं देखी गईं, जिन्हें हम "बिंदु" कहते हैं, जिनमें से कुछ को αS के साथ कोलोकलाइज़ किया गया था, और कुछ को Tau441 (छवि 5 ए, सफेद तीर) में समृद्ध किया गया था।ये धब्बे हमेशा αS/ΔNt-Tau की तुलना में αS/ΔNt-Tau के लिए राफ्ट के भीतर अधिक हद तक देखे गए हैं।संलयन/गीलापन के लिए अक्षम पीएलके और ताऊ प्रणालियों की बूंदों में कोई अलग-अलग धब्बे नहीं थे।यह जांचने के लिए कि क्या αS और Tau441 वाले ये दाग अमाइलॉइड-जैसे समुच्चय हैं, हमने CF माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एक समान प्रयोग किया जिसमें Tau441 को Atto647N के साथ लेबल किया गया था और शुरू से ही 12.5 μM अमाइलॉइड-विशिष्ट थियोफ्लेविन-टी (ThT) जोड़ा गया था।डाई.हालाँकि ऊष्मायन के 24 घंटे के बाद भी αS/Tau441 बूंदों या राफ्ट का ThT- धुंधलापन नहीं देखा गया (चित्र 5 बी, शीर्ष पंक्ति - प्रोटीन राफ्ट पर शेष बूंदें), राफ्ट के अंदर Atto647N-Tau441 युक्त ThT-पॉजिटिव संरचनाएं बहुत कमजोर थीं।यह पहले वर्णित धब्बों के आकार, आकार और स्थान को दोहराता है (चित्र 5 बी, मध्य और निचली पंक्तियाँ), यह सुझाव देता है कि धब्बे उम्र बढ़ने वाले तरल पदार्थ के कोसेर्वेट्स में गठित अमाइलॉइड-जैसे समुच्चय के अनुरूप हो सकते हैं।
एलएलपीएस बफर के साथ एक माइक्रोस्कोप प्लेट के कुएं में 25 μM Tau441 (1 μM AF488-लेबल αS और Atto647N-लेबल Tau441) की उपस्थिति में विभिन्न ऊष्मायन समय और फोकल ऊंचाई (z, अनबाउंड तल से दूरी) पर WF 25 μM αS) .समान परिणामों के साथ छह प्रयोग स्वतंत्र रूप से दोहराए गए।25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-लेबल Tau441) और 12.5 μM थियोफ्लेविन-टी (ThT) की उपस्थिति में 25 μM αS की b CF सूक्ष्म छवि।भारित प्रोटीन बूंदें और जमा प्रोटीन राफ्ट और धब्बे क्रमशः शीर्ष और मध्य पंक्तियों में दिखाए जाते हैं।नीचे की पंक्ति 3 स्वतंत्र प्रतिकृतियों से राफ्ट और ड्रॉप्स की छवियां दिखाती है।सफेद तीर दोनों पैनलों में ThT-पॉजिटिव बिंदुओं को दर्शाते हैं।सभी छवियों के लिए स्केल बार 20 µm है।
तरल से ठोस में संक्रमण के दौरान कोसेर्वेट प्रोटीन नेटवर्क में परिवर्तनों की अधिक विस्तार से जांच करने के लिए, हमने प्रतिदीप्ति जीवनकाल इमेजिंग (एफएलआईएम) और फोर्स्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण माइक्रोस्कोपी (एफआरईटी) (चित्रा 6 और पूरक आंकड़े 8 और 9) का उपयोग किया।हमने परिकल्पना की है कि परत के अधिक संघनित या यहां तक ​​कि ठोस जैसी एकत्रित प्रोटीन संरचना में परिपक्व होने से प्रोटीन और उससे जुड़ी फ्लोरोसेंट जांच के बीच निकट संपर्क होता है, जो संभावित रूप से एक छोटे जांच जीवनकाल (τ) में प्रकट शमन प्रभाव पैदा करता है। , जैसा कि पहले बताया गया है40।,41 ,42.इसके अलावा, डबल लेबल वाले नमूनों (क्रमशः AF488 और Atto647N को FRET दाता और स्वीकर्ता रंगों के रूप में) के लिए, τ में यह कमी एलएसपीटी के दौरान कोएसर्वेट संघनन और FRET (E) दक्षता में वृद्धि के साथ भी हो सकती है।हमने LLPS αS/Tau441 और αS/ΔNt-Tau नमूनों में समय के साथ बेड़ा और स्पॉट गठन की निगरानी की (LLPS बफर में प्रत्येक प्रोटीन का 25 µM जिसमें 1 µM AF488 लेबल αS और/या Atto647N लेबल Tau441 या ΔNt-Tau होता है)।हमने एक सामान्य प्रवृत्ति देखी कि AF488 (τ488) और Atto647N (τ647N) जांच का प्रतिदीप्ति जीवनकाल थोड़ा कम हो गया क्योंकि कोएसर्वेट्स परिपक्व हो गए (चित्र 6 और अनुपूरक चित्र 8c)।दिलचस्प बात यह है कि यह परिवर्तन राफ्ट के भीतर बिंदुओं के लिए काफी बढ़ाया गया था (चित्र 6 सी), यह दर्शाता है कि बिंदुओं पर आगे प्रोटीन संघनन हुआ।इसके समर्थन में, 24 घंटे की आयु वाले αS/ΔNt-Tau बूंदों के लिए प्रतिदीप्ति जीवनकाल में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं देखा गया (पूरक छवि 8डी), यह सुझाव देता है कि बूंदों का जमाव स्पॉटिंग से अलग प्रक्रिया है और यह महत्वपूर्ण आणविक पुनर्गठन के साथ नहीं है सहकार्वेट्स के भीतर.यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि αS में बिंदुओं के अलग-अलग आकार और परिवर्तनशील सामग्री होती है, विशेष रूप से αS/Tau441 सिस्टम के लिए (पूरक चित्र 8e)।स्पॉट प्रतिदीप्ति जीवनकाल में कमी के साथ तीव्रता में वृद्धि हुई, विशेष रूप से Atto647N लेबल Tau441 (अनुपूरक चित्र 8a) के लिए, और αS/Tau441 और αS/ΔNt-Tau दोनों प्रणालियों के लिए उच्च FRET दक्षता, जो एलएलपीएस में पांच घंटे में और संक्षेपण का संकेत देती है। ट्रिगर करने के बाद, स्थैतिक बिजली के अंदर के प्रोटीन संघनित हो गए।αS/ΔNt-Tau की तुलना में, हमने αS/Tau441 स्पॉट में कम τ647N और कुछ हद तक उच्च τ488 मान देखे, साथ ही कम और अधिक अमानवीय FRET मान भी देखे।संभवतः, यह इस तथ्य से संबंधित हो सकता है कि αS/Tau441 प्रणाली में, समुच्चय में देखी गई और अपेक्षित αS बहुतायत अधिक विषम है, अक्सर Tau की तुलना में सबस्टोइकोमेट्रिक है, क्योंकि Tau441 स्वयं भी LLPS और एकत्रीकरण से गुजर सकता है (पूरक छवि 8e) .हालाँकि, जब Tau441 और αS दोनों मौजूद होते हैं, तो बूंदों के सहसंयोजन, बेड़ा गठन और, महत्वपूर्ण रूप से, तरल जैसे कोसेर्वेट्स के भीतर प्रोटीन एकत्रीकरण की डिग्री अधिकतम होती है।
एलएलपीएस बफर में प्रत्येक प्रोटीन के 25 μM (1 μM AF488-लेबल αS और 1 μM Atto647N-लेबल Tau441 या ΔNt-Tau) पर αS/Tau441 और αS/ΔNt-Tau की लाइफटाइम प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (FLIM) छवियां।कॉलम अलग-अलग परिपक्वता समय (30 मिनट, 5 घंटे और 24 घंटे) पर एलएलपीएस नमूनों की प्रतिनिधि छवियां दिखाते हैं।लाल फ्रेम αS/Tau441 स्पॉट वाले क्षेत्र को दर्शाता है।जीवन काल को रंगीन पट्टियों के रूप में दिखाया गया है।सभी छवियों के लिए स्केल बार = 20 µm.b चयनित क्षेत्र की ज़ूम-इन FLIM छवि, पैनल a में लाल बॉक्स में दिखाई गई है।जीवन सीमा को पैनल ए के समान रंग पैमाने का उपयोग करके दिखाया गया है।स्केल बार = 5 µm.सी हिस्टोग्राम विभिन्न प्रोटीन प्रजातियों (बूंदों-डी-, राफ्ट-आर- और स्पेकल-पी) के लिए एएफ488 (αS से जुड़ा हुआ) या एटो647एन (ताऊ से जुड़ा हुआ) दिखा रहे हैं, जो αS- के लिए रिकॉर्ड की गई FLIM छवियों में पहचाने गए हैं) Tau441 का समय वितरण जीवनकाल और αS/ΔNt-Tau कोएसर्वेट नमूने (एन = डी के लिए 17-32 आरओआई, आर के लिए 29-44 आरओआई, और अंकों के लिए 21-51 आरओआई)।माध्य और माध्य मान क्रमशः बक्सों के अंदर पीले वर्गों और काली रेखाओं के रूप में दिखाए जाते हैं।बॉक्स की निचली और ऊपरी सीमाएं क्रमशः पहली और तीसरी चतुर्थक का प्रतिनिधित्व करती हैं, और 1.5-गुना इंटरक्वेर्टाइल रेंज (आईक्यूआर) के भीतर न्यूनतम और अधिकतम मान मूंछ के रूप में दिखाए जाते हैं।आउटलेर्स को काले हीरे के रूप में दिखाया गया है।असमान भिन्नताओं को मानते हुए, वितरण के जोड़े के बीच सांख्यिकीय महत्व दो-नमूना टी-परीक्षण का उपयोग करके निर्धारित किया गया था।दो-पूंछ वाले टी-परीक्षण पी-मान तुलनात्मक डेटा की प्रत्येक जोड़ी के लिए तारांकन के साथ दिखाए जाते हैं (* पी-मान> 0.01, ** पी-मान> 0.001, *** पी-मूल्य> 0.0001, **** पी-वैल्यू > 0.00001), एनएस नगण्यता को दर्शाता है (पी-वैल्यू > 0.05)।सटीक पी मान पूरक तालिका 1 में दिए गए हैं, और मूल डेटा को कच्चे डेटा फ़ाइलों के रूप में प्रस्तुत किया गया है।
धब्बों/समुच्चय की अमाइलॉइड जैसी प्रकृति को और अधिक प्रदर्शित करने के लिए, हमने 24 घंटों के लिए बिना दाग वाले कोएसर्वेट नमूनों को (1 एम) NaCl की उच्च सांद्रता के साथ उपचारित किया, जिसके परिणामस्वरूप प्रोटीन कोएसर्वेट से समुच्चय अलग हो गए।जब परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) का उपयोग करके पृथक समुच्चय (यानी, समुच्चय का एक फैला हुआ समाधान) देखा गया, तो हमने लगभग 15 एनएम की नियमित ऊंचाई के साथ मुख्य रूप से गोलाकार आकृति विज्ञान देखा, जो उच्च नमक एकाग्रता की स्थितियों के तहत जुड़ा हुआ है, जैसा कि सतह पर मजबूत हाइड्रोफोबिक प्रभाव के कारण विशिष्ट अमाइलॉइड फाइब्रिल का व्यवहार (ध्यान दें कि फाइब्रिल की ऊंचाई आमतौर पर ~ 10 एनएम है) (पूरक चित्र 10 ए)।दिलचस्प बात यह है कि जब पृथक समुच्चय को एक मानक ThT प्रतिदीप्ति परख में ThT के साथ ऊष्मायन किया गया था, तो हमने ThT प्रतिदीप्ति क्वांटम उपज में एक नाटकीय वृद्धि देखी, जो कि तब देखी गई जब डाई को विशिष्ट αS अमाइलॉइड फाइब्रिल (पूरक छवि 10 बी) के साथ ऊष्मायन किया गया था, यह सुझाव देता है कि कोएसर्वेट समुच्चय में अमाइलॉइड जैसी संरचनाएं होती हैं।.वास्तव में, समुच्चय उच्च नमक सांद्रता के प्रति सहनशील थे, लेकिन विशिष्ट अमाइलॉइड फाइब्रिल (पूरक चित्र 10 सी) की तरह, 4 एम गुआनिडाइन क्लोराइड (जीडीएनएचसीएल) के प्रति संवेदनशील थे।
इसके बाद, हमने एकल अणु प्रतिदीप्ति, विशिष्ट प्रतिदीप्ति सहसंबंध/क्रॉस-सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफसीएस/एफसीसीएस), और दो-रंग संयोग पहचान (टीसीसीडी) के विस्फोट विश्लेषण का उपयोग करके समुच्चय की संरचना का विश्लेषण किया।इस प्रयोजन के लिए, हमने αS और Tau441 (दोनों 25 μM) वाले 1 μM AF488-लेबल αS और 1 μM Atto647N-लेबल Tau441 वाले 100 μl LLPS नमूनों में 24 घंटे के ऊष्मायन के बाद बने समुच्चय को अलग किया।एलएलपीएस और प्रोटीन के बीच किसी भी संभावित इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन को रोकने के लिए समान पीईजी-मुक्त बफर और 1 एम NaCl (कोएसर्वेट से समुच्चय को अलग करने के लिए उपयोग किया जाने वाला समान बफर) का उपयोग करके परिणामी बिखरे हुए समुच्चय समाधान को एक मोनोमोलेक्युलर अवस्था में पतला करें।एकल अणु के समय प्रक्षेपवक्र का एक उदाहरण चित्र 7ए में देखा जा सकता है।एफसीसीएस/एफसीएस विश्लेषण (क्रॉस-सहसंबंध, सीसी और ऑटोसहसंबंध, एसी) से पता चला कि नमूनों में αS और ताऊ युक्त समुच्चय प्रचुर मात्रा में थे (चित्र 7 बी, बाएं पैनल में सीसी वक्र देखें), और अवशिष्ट मोनोमेरिक प्रोटीन की अधिकता एक के रूप में उत्पन्न हुई। तनुकरण प्रक्रिया का परिणाम (चित्र 7बी, बाएँ पैनल में एसी वक्र देखें)।केवल मोनोमेरिक प्रोटीन वाले नमूनों का उपयोग करके समान समाधान स्थितियों के तहत किए गए नियंत्रण प्रयोगों में कोई सीसी वक्र नहीं दिखा, और एसी वक्र एक-घटक प्रसार मॉडल (ईक्यू 4) के साथ अच्छी तरह से फिट होते हैं, जहां मोनोमेरिक प्रोटीन में अपेक्षित प्रसार गुणांक होते हैं (चित्र 7 बी) ), दायां पैनल)।एकत्रित कणों का प्रसार गुणांक 1 µm2/s से कम है, और मोनोमेरिक प्रोटीन का प्रसार गुणांक लगभग 1 µm2/s है।50-100 µm/s;मान समान समाधान स्थितियों44 के तहत अलग-अलग सोनिकेटेड αS अमाइलॉइड फाइब्रिल और मोनोमेरिक αS के लिए पहले प्रकाशित मूल्यों के समान हैं।जब हमने टीसीसीडी विस्फोट विश्लेषण (छवि 7 सी, शीर्ष पैनल) के साथ समुच्चय का विश्लेषण किया, तो हमने पाया कि प्रत्येक पृथक समुच्चय (αS/Tau हेटरोएग्रीगेट) में, लगभग 60% पाए गए समुच्चय में αS और tau दोनों शामिल थे, लगभग 30% में केवल ताउ, लगभग 10% αS केवल।αS/Tau हेटेरोएग्रीगेट्स के स्टोइकोमेट्रिक विश्लेषण से पता चला है कि अधिकांश हेटेरोएग्रीगेट्स टाउ में समृद्ध थे (स्टोइकोमेट्री 0.5 से नीचे, प्रति समुच्चय टाउ अणुओं की औसत संख्या αS अणुओं से 4 गुना अधिक है), जो कि FLIM इन सीटू में देखे गए हमारे काम के अनुरूप है। प्रयोग..FRET विश्लेषण से पता चला कि इन समुच्चय में दोनों प्रोटीन शामिल थे, हालांकि इस मामले में वास्तविक FRET मान बहुत महत्वपूर्ण नहीं हैं, क्योंकि प्रयोग में उपयोग किए गए बिना लेबल वाले प्रोटीन की अधिकता के कारण प्रत्येक समुच्चय में फ्लोरोफोरस का वितरण यादृच्छिक था।दिलचस्प बात यह है कि जब हमने 45,46 परिपक्व अमाइलॉइड एकत्रीकरण-कमी वाले ताऊ वैरिएंट (पूरक छवि 11 ए, बी देखें) का उपयोग करके एक ही विश्लेषण किया, तो हमने देखा कि हालांकि αS इलेक्ट्रोस्टैटिक एकत्रीकरण समान था (पूरक छवि 11 सी, डी), कोएसर्वेट के भीतर समुच्चय बनाने की क्षमता काफी कम हो गई थी और एफएलआईएम ने सीटू प्रयोगों में कई स्थानों का पता लगाया था, और पृथक समुच्चय नमूनों के लिए कमजोर क्रॉस-सहसंबंध वक्र देखे गए थे।हालाँकि, ज्ञात समुच्चय की एक छोटी संख्या (Tau441 का केवल दसवां हिस्सा) के लिए, हमने देखा कि प्रत्येक समुच्चय इस Tau संस्करण की तुलना में αS में समृद्ध था, लगभग 50% ज्ञात समुच्चय में केवल αS अणु थे, और αS अधिक मात्रा में विषम था। .समुच्चय (पूरक चित्र 11e देखें), Tau441 (चित्र 6f) द्वारा उत्पन्न विषम समुच्चय के विपरीत।इन प्रयोगों के परिणामों से पता चला कि यद्यपि αS स्वयं कोएसर्वेट के भीतर ताऊ के साथ जमा होने में सक्षम है, इन परिस्थितियों में ताऊ न्यूक्लियेशन अधिक अनुकूल है, और परिणामी अमाइलॉइड-जैसे समुच्चय αS और ताऊ के रूप में कार्य करने में सक्षम हैं।हालाँकि, एक बार जब एक ताऊ-समृद्ध कोर बन जाता है, तो αS और ताऊ के बीच हेटरोटाइपिक इंटरैक्शन को टाऊ अणुओं के बीच होमोटाइपिक इंटरैक्शन की तुलना में समुच्चय में पसंद किया जाता है;हम तरल αS/tau coacervetes में प्रोटीन नेटवर्क का भी निरीक्षण करते हैं।
αS/Tau441 इलेक्ट्रोस्टैटिक कोएसर्वेट्स में गठित पृथक समुच्चय के एकल अणुओं के प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति अस्थायी निशान।αS/Tau441 सहसमूहों के अनुरूप विस्फोट (संकेतित सीमा से ऊपर विस्फोट) तीन पहचान चैनलों (प्रत्यक्ष उत्तेजना के बाद AF488 और Atto647N उत्सर्जन, नीली और लाल रेखाएं, अप्रत्यक्ष उत्तेजना के बाद Atto647N उत्सर्जन), FRET, बैंगनी रेखा) में देखे गए।एलएलपीएस (बाएं पैनल) से प्राप्त पृथक αS/Tau441 समुच्चय के नमूने का बी एफसीएस/एफसीसीएस विश्लेषण।AF488 और Atto647N के लिए ऑटोसहसंबंध (AC) वक्र क्रमशः नीले और लाल रंग में दिखाए गए हैं, और दोनों रंगों वाले समुच्चय से जुड़े क्रॉस-सहसंबंध (CC) वक्र बैंगनी रंग में दिखाए गए हैं।एसी वक्र लेबल वाले मोनोमेरिक और एकत्रित प्रोटीन प्रजातियों की उपस्थिति को दर्शाते हैं, जबकि सीसी वक्र केवल डबल-लेबल समुच्चय का प्रसार दिखाते हैं।समान विश्लेषण, लेकिन अलग-अलग स्थानों में समान समाधान स्थितियों के तहत, केवल मोनोमेरिक αS और Tau441 वाले नमूने सही पैनल में नियंत्रण के रूप में दिखाए जाते हैं।सी αS/Tau441 इलेक्ट्रोस्टैटिक कोएसर्वेट्स में गठित पृथक समुच्चय के एकल अणुओं का प्रतिदीप्ति फ्लैश विश्लेषण।चार अलग-अलग दोहरावों (एन = 152) में पाए गए प्रत्येक समुच्चय की जानकारी उनके स्टोइकोमेट्री, एस मूल्यों और एफआरईटी दक्षता (शीर्ष पैनल, रंग पट्टी घटना को दर्शाती है) के विरुद्ध प्लॉट की गई है।तीन प्रकार के समुच्चय को प्रतिष्ठित किया जा सकता है: -αS-केवल S~1 और FRET~0 के साथ समुच्चय, S~0 और FRET~1 के साथ Tau-केवल समुच्चय, और मध्यवर्ती S और FRET~1 के साथ विषम Tau/αS समुच्चय राशि का अनुमान प्रत्येक विषम समुच्चय (एन = 100) में पाए गए दोनों मार्कर प्रोटीनों को निचले पैनल में दिखाया गया है (रंग स्केल घटना को दर्शाता है)।कच्चा डेटा कच्ची डेटा फ़ाइलों के रूप में प्रदान किया जाता है।
समय के साथ जेल जैसी या ठोस संरचनाओं में संघनित होने वाले तरल प्रोटीन की परिपक्वता या उम्र बढ़ने के साथ-साथ कंडेनसेट47 के कई शारीरिक कार्यों के साथ-साथ बीमारी में भी शामिल होने की सूचना मिली है, जो कि अमाइलॉइड एकत्रीकरण 7, 48, 49 से पहले की एक असामान्य प्रक्रिया है। हम चरण पृथक्करण और व्यवहार का विस्तार से अध्ययन करते हैं।एलपीएसटी αS कम माइक्रोमोलर सांद्रता और शारीरिक रूप से प्रासंगिक स्थितियों में नियंत्रित वातावरण में यादृच्छिक पॉलीकेशन की उपस्थिति में (ध्यान दें कि αS की गणना की गई शारीरिक एकाग्रता> 1 µM50 है), एलपीएस के विशिष्ट थर्मोडायनामिक रूप से संचालित व्यवहार के बाद।हमने पाया कि αS, जिसमें शारीरिक pH पर अत्यधिक नकारात्मक रूप से चार्ज किया गया C-टर्मिनल क्षेत्र होता है, इलेक्ट्रोस्टैटिक की प्रक्रिया के माध्यम से pLK या Tau जैसे अत्यधिक cationic अव्यवस्थित पेप्टाइड्स की उपस्थिति में LLPS के माध्यम से जलीय घोल में प्रोटीन युक्त बूंदें बनाने में सक्षम है। एकत्रीकरण मैक्रोमोलेक्यूल्स की उपस्थिति में जटिल संघनन।इस प्रक्रिया का सेलुलर वातावरण में प्रासंगिक प्रभाव हो सकता है जहां αS इन विट्रो और विवो51,52,53,54 दोनों में इसके रोग-संबंधित एकत्रीकरण से जुड़े विभिन्न पॉलीकेशनिक अणुओं का सामना करता है।
कई अध्ययनों में, बूंदों के भीतर प्रोटीन की गतिशीलता को परिपक्वता प्रक्रिया निर्धारित करने वाले प्रमुख कारकों में से एक माना गया है।इलेक्ट्रोस्टैटिक αS में पॉलीकेशन के साथ सहसंयोजन होता है, परिपक्वता प्रक्रिया स्पष्ट रूप से पॉलीकेशन, वैलेंस और इन इंटरैक्शन की बहुलता के साथ बातचीत की ताकत पर निर्भर करती है।संतुलन सिद्धांत से पता चलता है कि दो तरल अवस्थाओं का संतुलन परिदृश्य बायोपॉलिमर से समृद्ध एक बड़ी बूंद की उपस्थिति होगी जो एलएलपीएस57,58 को संचालित करती है।बूंदों की वृद्धि ओस्टवाल्ड परिपक्वता59, सहसंयोजन60 या बिखरे हुए चरण61 में मुक्त मोनोमर की खपत द्वारा प्राप्त की जा सकती है।αS और Tau441, ΔNt-Tau या pLK के लिए, इस अध्ययन में उपयोग की गई शर्तों के तहत अधिकांश प्रोटीन कंडेनसेट में केंद्रित था।हालाँकि, जबकि पूर्ण आकार की ताऊ बूंदें सतह के गीला होने पर तेजी से एकत्रित होती हैं, बूंदों का सहसंयोजन और गीलापन ΔNt-Tau और pLK के लिए मुश्किल था, जो इन दोनों प्रणालियों में तरल गुणों के तेजी से नुकसान का सुझाव देता है।हमारे FLIM-FRET विश्लेषण के अनुसार, वृद्ध pLK और ΔNt-Tau बूंदों ने मूल बूंदों के समान प्रोटीन एकत्रीकरण (समान प्रतिदीप्ति जीवनकाल) दिखाया, जिससे पता चलता है कि मूल प्रोटीन नेटवर्क बरकरार रखा गया था, यद्यपि अधिक कठोर।
हम निम्नलिखित मॉडल में अपने प्रयोगात्मक परिणामों को तर्कसंगत बनाते हैं (चित्र 8)।आरंभ में अस्थायी रूप से बनी बूंदें अक्सर इलेक्ट्रोस्टैटिक क्षतिपूर्ति के बिना प्रोटीन नेटवर्क होती हैं, और इस प्रकार चार्ज असंतुलन के क्षेत्र होते हैं, विशेष रूप से बूंद इंटरफ़ेस पर, जिसके परिणामस्वरूप उच्च इलेक्ट्रोस्टैटिक सतह क्षमता वाली बूंदें बनती हैं।चार्ज की भरपाई करने के लिए (एक घटना जिसे आमतौर पर वैलेंस कमी के रूप में जाना जाता है) और बूंदों की सतह क्षमता को कम करने के लिए, बूंदों में पतला चरण से नए पॉलीपेप्टाइड शामिल हो सकते हैं, चार्ज-चार्ज इंटरैक्शन को अनुकूलित करने के लिए प्रोटीन नेटवर्क को पुनर्गठित किया जा सकता है, और अन्य बूंदों के साथ बातचीत की जा सकती है।सतहों के साथ (गीला होना)।αS/pLK बूंदें, अपने सरल प्रोटीन नेटवर्क (αS और pLK के बीच केवल हेटेरोटाइपिक इंटरैक्शन) और प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के लिए अधिक आत्मीयता के कारण, कंडेनसेट के चार्ज को अधिक तेज़ी से संतुलित करने में सक्षम प्रतीत होती हैं;वास्तव में, हमने αS/Tau की तुलना में आरंभिक रूप से निर्मित αS/pLK कोएसर्वेट्स में तेज़ प्रोटीन कैनेटीक्स देखा।संयोजकता में कमी के बाद, अंतःक्रियाएं कम अल्पकालिक हो जाती हैं और बूंदें अपने तरल गुणों को खो देती हैं और कम इलेक्ट्रोस्टैटिक सतह क्षमता के साथ जेल जैसी, गैर-ज्वलनशील बूंदों में बदल जाती हैं (और इसलिए सतह को गीला करने में असमर्थ होती हैं)।इसके विपरीत, अधिक जटिल प्रोटीन नेटवर्क (होमोटाइपिक और हेटरोटाइपिक इंटरैक्शन दोनों के साथ) और प्रोटीन इंटरैक्शन की कमजोर प्रकृति के कारण αS/ताऊ बूंदें ड्रॉपलेट चार्ज संतुलन को अनुकूलित करने में कम कुशल हैं।इसके परिणामस्वरूप बूंदें लंबे समय तक तरल व्यवहार बनाए रखती हैं और एक उच्च इलेक्ट्रोस्टैटिक सतह क्षमता प्रदर्शित करती हैं जो एकजुट होने और बढ़ने (इस प्रकार बूंदों के सतह क्षेत्र/आयतन अनुपात को कम करने) और हाइड्रोफिलिक सतह रसायन को गीला करने से कम हो जाती है।यह बड़े संकेंद्रित प्रोटीन पुस्तकालय बनाता है जो द्रव गुणों को बरकरार रखता है क्योंकि प्रोटीन नेटवर्क में चार्ज अनुकूलन की निरंतर खोज के कारण इंटरैक्शन बहुत क्षणिक रहता है।दिलचस्प बात यह है कि ताऊ के एन-टर्मली रूप से काटे गए रूप, जिनमें कुछ प्राकृतिक रूप से पाए जाने वाले आइसोफोर्म्स62 भी शामिल हैं, मध्यवर्ती व्यवहार प्रदर्शित करते हैं, जिसमें कुछ कोएसर्वेट αS के साथ लंबे समय तक रहने वाली जेल जैसी बूंदों में उम्र बढ़ने लगते हैं, जबकि अन्य बड़े तरल संघनन में बदल जाते हैं।αS इलेक्ट्रोस्टैटिक कोएसर्वेट्स की परिपक्वता में यह द्वंद्व हाल के एलएलपीएस सैद्धांतिक और प्रयोगात्मक अध्ययनों के अनुरूप है, जिन्होंने कंडेनसेट आकार और द्रव गुणों को नियंत्रित करने की कुंजी के रूप में कंडेनसेट में वैलेंस कमी और इलेक्ट्रोस्टैटिक सिविंग के बीच सहसंबंध की पहचान की है।तंत्र 58.61.
यह योजना एलएलपीएस और एलएसपीटी के माध्यम से αS और Tau441 के लिए अनुमानित अमाइलॉइड एकत्रीकरण मार्ग दिखाती है।अतिरिक्त आयन-समृद्ध (लाल) और धनायन-समृद्ध (नीला) क्षेत्रों के साथ, संतोषजनक वैलेंस के साथ αS और ताऊ इलेक्ट्रोस्टैटिक कोएसर्वेट्स की सतह ऊर्जा कम होती है और इसलिए कम सहसंयोजन होता है, जिसके परिणामस्वरूप तेजी से बूंद उम्र बढ़ती है।एक स्थिर गैर-एग्लोमेरेटेड जेल अवस्था प्राप्त की जाती है।.यह स्थिति αS/pLK प्रणाली के मामले में इसकी उच्च आत्मीयता और सरल प्रोटीन-जोड़ी इंटरैक्शन नेटवर्क के कारण बहुत अनुकूल है, जो तेज़ जेल-जैसे संक्रमण की अनुमति देती है।इसके विपरीत, असंतोषजनक संयोजकता वाली बूंदें और, इसलिए, परस्पर क्रिया के लिए उपलब्ध प्रोटीन-आवेशित क्षेत्र, इसकी उच्च सतह ऊर्जा को कम करने के लिए कोएसर्वेट के लिए हाइड्रोफिलिक सतह को फ्यूज करना और गीला करना आसान बनाते हैं।यह स्थिति αS/Tau441 कोएसर्वेट्स के लिए बेहतर है, जिसमें कमजोर ताऊ-ताउ और αS-ताउ इंटरैक्शन से युक्त एक बहुसंयोजक जटिल नेटवर्क है।बदले में, बड़े कोएसर्वेट अधिक आसानी से अपने तरल पदार्थ जैसे गुणों को बनाए रखेंगे, जिससे अन्य प्रोटीन-से-प्रोटीन इंटरैक्शन होने की अनुमति मिलेगी।अंततः, कोएसर्वेट द्रव के भीतर αS और tau दोनों युक्त अमाइलॉइड विषम समुच्चय बनते हैं, जो समावेशन निकायों में पाए जाने वाले से संबंधित हो सकते हैं, जो न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के लक्षण हैं।
अत्यधिक भीड़भाड़ वाले लेकिन गतिशील प्रोटीन वातावरण के साथ αS/Tau441 की परिपक्वता के दौरान बनने वाली बड़ी तरल पदार्थ जैसी संरचनाएं और, कुछ हद तक, αS/ΔNt-Tau कोएकर्वेट्स प्रोटीन एकत्रीकरण के न्यूक्लियेशन के लिए आदर्श जलाशय हैं।हमने वास्तव में इस प्रकार के प्रोटीन कोएसर्वेट में ठोस प्रोटीन समुच्चय का निर्माण देखा है, जिसमें अक्सर αS और tau दोनों होते हैं।हमने दिखाया है कि ये हेटेरोएग्रीगेट्स गैर-इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन द्वारा स्थिर होते हैं, अमाइलॉइड-विशिष्ट ThT रंगों को विशिष्ट अमाइलॉइड फाइब्रिल की तरह ही बांधने में सक्षम होते हैं, और वास्तव में विभिन्न प्रभावों के लिए समान प्रतिरोध रखते हैं।एलएलपीएस द्वारा गठित αS/tau समुच्चय में अमाइलॉइड जैसे गुण पाए गए।वास्तव में, अमाइलॉइड एकत्रीकरण में कमी वाले ताऊ के परिपक्व संस्करण में तरल इलेक्ट्रोस्टैटिक कोसेर्वेट के भीतर इन विषम αS समुच्चय के निर्माण में काफी कमी आई है।αS/Tau441 समुच्चय का निर्माण केवल कोएसर्वेट्स के अंदर देखा गया, जिसमें तरल जैसे गुण बरकरार रहे, और कभी नहीं, यदि कोएसर्वेट्स/बूंदें जेल अवस्था तक नहीं पहुंचीं।बाद के मामले में, इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन की बढ़ी हुई ताकत और, परिणामस्वरूप, प्रोटीन नेटवर्क की कठोरता अमाइलॉइड न्यूक्लिएशन के लिए आवश्यक नए प्रोटीन इंटरैक्शन स्थापित करने के लिए प्रोटीन के आवश्यक गठनात्मक पुनर्व्यवस्था को रोकती है।हालाँकि, इसे अधिक लचीले, तरल जैसे कोएसर्वेट में प्राप्त किया जा सकता है, जो आकार में बढ़ने के साथ-साथ तरल बने रहने की अधिक संभावना रखते हैं।
तथ्य यह है कि संघनित चरण के भीतर समुच्चय का निर्माण तेजी से जेल जाने वाली छोटी बूंदों की तुलना में बड़े αS/ताऊ संघनन में बेहतर होता है, जो बूंदों के सहसंयोजन को नियंत्रित करने वाले कारकों की पहचान करने की प्रासंगिकता पर प्रकाश डालता है।इस प्रकार, न केवल चरण पृथक्करण की प्रवृत्ति होती है, बल्कि समुचित कार्य के साथ-साथ रोग की रोकथाम58,61 के लिए कंडेनसेट के आकार को नियंत्रित किया जाना चाहिए।हमारे परिणाम αS/Tau प्रणाली के लिए LLPS और LSPT के बीच संतुलन के महत्व पर भी प्रकाश डालते हैं।जबकि बूंदों का निर्माण संतृप्ति स्थितियों के तहत उपलब्ध प्रोटीन मोनोमर्स की मात्रा को कम करके अमाइलॉइड एकत्रीकरण से रक्षा कर सकता है, जैसा कि अन्य प्रणालियों63,64 में प्रस्तावित किया गया है, उच्च बूंद स्तर पर बूंद संलयन धीमी गठनात्मक पुनर्व्यवस्था के माध्यम से आंतरिक प्रोटीन एकत्रीकरण को जन्म दे सकता है।प्रोटीन नेटवर्क..
कुल मिलाकर, हमारा डेटा एलएसपीटी के संदर्भ में ड्रॉप नेटवर्क में एकजुट वैलेंस और संतुष्ट/असंतुष्ट इंटरैक्शन की प्रासंगिकता पर जोर देता है।विशेष रूप से, हम दिखाते हैं कि पूर्ण-लंबाई αS/Tau441 कंडेनसेट कुशलतापूर्वक फ्यूज और न्यूक्लियेट करने में सक्षम हैं ताकि अमाइलॉइड-जैसे हेटरोएग्रीगेट्स बन सकें जिनमें दोनों प्रोटीन शामिल हैं और हमारे प्रयोगात्मक परिणामों के आधार पर एक आणविक तंत्र का प्रस्ताव देते हैं।αS/Tau द्रव कोसेर्वेट में दो प्रोटीनों का सह-एकत्रीकरण, जिसकी हम यहां रिपोर्ट करते हैं, वास्तव में समावेशन में दो प्रोटीनों के सह-स्थानीयकरण से संबंधित हो सकता है, जो रोग की पहचान हैं, और एलएलपीएस और के बीच संबंध को समझने में योगदान कर सकते हैं। अमाइलॉइड एकत्रीकरण, न्यूरोडीजेनेरेशन में अत्यधिक चार्ज आईडीपी के लिए मार्ग प्रशस्त करता है।
मोनोमेरिक WT-αS, सिस्टीन म्यूटेंट (Q24C-αS, N122C-αS) और ΔCt-αS वेरिएंट (Δ101-140) को ई. कोली में व्यक्त किया गया और पहले बताए अनुसार शुद्ध किया गया।डाइसल्फ़ाइड बंधन गठन को रोकने के लिए αS सिस्टीन म्यूटेंट के शुद्धिकरण में सभी चरणों में 5 मिमी डीटीटी को शामिल किया गया था।Tau441 आइसोफॉर्म (Addgene #16316 से प्राप्त प्लास्मिड), ΔNt-Tau वैरिएंट (Δ1-150, प्राइमर CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTTCTTAAAGTTAAAC) और AggDef-Tau वैरिएंट (Δ275-311, GGCTC5 प्राइमर से शुद्ध) के साथ IVA क्लोनिंग द्वारा प्राप्त किया गया। कोली संस्कृतियाँ थीं 37°C और 180 rpm पर OD600 = 0.6–0.7 तक बढ़ गया, और अभिव्यक्ति को 37°C पर 3 घंटे के लिए IPTG के साथ प्रेरित किया गया।4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 11,500 xg पर कोशिकाओं को इकट्ठा करें और 150 एमएम NaCl युक्त खारा बफर से धोएं।लाइसिस बफर में गोली को फिर से निलंबित करें (20 मिली प्रति 1 एल एलबी: एमईएस 20 एमएम, पीएच 6.8, एनएसीएल 500 एमएम, ईडीटीए 1 एमएम, एमजीसीएल2 0.2 एमएम, डीटीटी 5 एमएम, पीएमएसएफ 1 एमएम, बेंज़ामिडीन 50 μM, कोपेप्टिन 100 μM)।सोनिकेशन चरण बर्फ पर 10 पल्स (1 मिनट चालू, 1 मिनट बंद) के लिए 80% के आयाम के साथ किया गया था।एक अल्ट्रासाउंड में 60 मिलीलीटर से अधिक न हो।ई. कोली लाइसेट्स को 95° C पर 20 मिनट के लिए गर्म किया गया, फिर बर्फ पर ठंडा किया गया और 40 मिनट के लिए 127,000×g पर सेंट्रीफ्यूज किया गया।स्पष्ट सतह पर तैरनेवाला को 3.5 केडीए झिल्ली (स्पेक्ट्रम ™ थर्मो फिशर साइंटिफिक, यूके) पर लागू किया गया था और डायलिसिस बफर के 4 एल (20 मिमी एमईएस, पीएच 6.8, NaCl 50 मिमी, EDTA 1 मिमी, एमजीसीएल 2 2 मिमी, डीटीटी 2 मिमी) के खिलाफ डायल किया गया था। , पीएमएसएफ 0.1 एमएम) 10 घंटे के लिए।एक 5 मिली कटियन एक्सचेंज कॉलम (हाईट्रैप एसपीएफएफ, साइटिवा, एमए, यूएसए) को संतुलन बफर (20 मिमी एमईएस, पीएच 6.8, 50 मिमी NaCl, 1 मिमी EDTA, 2 मिमी MgCl2, 2 मिमी DTT, 0.1 मिमी PMSF) के साथ संतुलित किया गया था।टाऊ लाइसेट को 0.22 माइक्रोन पीवीडीएफ फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर किया गया और 1 मिली/मिनट की प्रवाह दर पर कॉलम में इंजेक्ट किया गया।धीरे-धीरे निक्षालन किया गया, ताऊ को 15-30% निक्षालन बफर (20 मिमी एमईएस, पीएच 6.8, 1 एम NaCl, 1 मिमी EDTA, 2 मिमी एमजीसीएल2, 2 मिमी डीटीटी, 0.1 मिमी पीएमएसएफ) के साथ निस्तारित किया गया।अंशों का विश्लेषण एसडीएस-पेज द्वारा किया गया था, और ताऊ के अपेक्षित आणविक भार के साथ एक बैंड वाले किसी भी अंश को 10 केडीए सेंट्रीफ्यूज फिल्टर का उपयोग करके केंद्रित किया गया था और 10 मिमी एचईपीईएस, पीएच 7.4, NaCl 500 मिमी और डीटीटी 2 मिमी युक्त बफर के साथ प्रतिस्थापित किया गया था। अंतिम प्रोटीन सांद्रता 100 μM थी।फिर प्रोटीन घोल को 0.22 μm PVDF फिल्टर से गुजारा गया, जल्दी से जमाया गया और -80°C पर संग्रहित किया गया।प्रोटीन K18 प्रोफेसर अल्बर्टो बोफ़ी द्वारा प्रदान किया गया था।एसडीएस-पेज और मालदी-टीओएफ/टीओएफ द्वारा पुष्टि के अनुसार तैयारी की शुद्धता >95% थी।विभिन्न सिस्टीन को रासायनिक रूप से एलेक्साफ्लोर488-मेलीमाइड (एएफ488, थर्मोफिशर साइंटिफिक, वाल्थम, एमए, यूएसए) या टेमपोल-मेलीमाइड (टोरंटो रिसर्च केमिकल्स, टोरंटो, कनाडा) के साथ लेबल किया गया था।अवशोषण और MALDI-TOF/TOF द्वारा पुष्टि की गई।Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau और K18 को उसी प्रक्रिया का पालन करते हुए Atto647N-Maleimide (ATTO-TEC GmbH, सिएजेन, जर्मनी) का उपयोग करके 191 और 322 पदों पर देशी सिस्टीन अवशेषों के साथ लेबल किया गया था।αS और Tau441 के लिए प्रति अवशेष मानचित्र पर शुद्ध शुल्क CIDER66 का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था।
ठोस पॉली-एल-लाइसिन (आपूर्तिकर्ता, अलमांडा पॉलिमर इंक, हंट्सविले, अलबामा, यूएसए से एनएमआर के अनुसार पीएलके डीपी 90-110) को 10 मिमी एचईपीईएस, 100 मिमी NaCl, पीएच 7.4 से 10 मिमी एकाग्रता में भंग कर दिया गया था, प्रक्रिया 5 के लिए सोनिकेटेड थी। अल्ट्रासोनिक जल स्नान में कुछ मिनटों तक रखें और -20°C पर संग्रहित करें।पीईजी-8, डेक्सट्रान-70, एफआईटीसी-पीईजी-10 (बायोकेमपेग, वॉटरटाउन, एमए, यूएसए) और एफआईटीसी-डेक्सट्रान-500 (सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमआई, यूएसए) पानी में घुलनशील हैं और एलएलपीएस बफर में व्यापक रूप से वितरित हैं।डायलिसिस से दूषित लवण निकल जाते हैं।फिर उन्हें 0.22 माइक्रोन के छिद्र आकार के साथ एक सिरिंज फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर किया गया, और उनकी सांद्रता की गणना एक रेफ्रेक्टोमीटर (मेटलर टोलेडो, कोलंबस, ओहियो, यूएसए) का उपयोग करके की गई।एलएलपीएस नमूने निम्नलिखित क्रम में कमरे के तापमान पर तैयार किए गए थे: बफर और एक्सट्रूज़न मिश्रित थे और 1 मिमी ट्रिस (2-कार्बोक्सीथाइल) फॉस्फीन (टीसीईपी, कार्बोसिंथ, कॉम्पटन, यूके), 1 मिमी 2,2,2,2- (एथेन-) 1, 2-डायल्डिनिट्राइल) टेट्राएसिटिक एसिड (ईडीटीए, कार्बोक्सिन्थ) और 1% प्रोटीज अवरोधक (पीएमएसएफ 100 एमएम, बेंज़िमाइड 1 एमएम, ल्यूपेप्टिन 5 μM) का मिश्रण।फिर αS और फ़्यूज्ड पॉलीकेशन (विकल्प pLK या Tau) जोड़े जाते हैं।थियोफ्लेविन-टी समय श्रृंखला प्रयोगों (टीएचटी, कार्बोसिंथ, कॉम्पटन, यूके) के लिए, कुल टीएचटी एकाग्रता का उपयोग αS एकाग्रता का आधा होने के लिए करें।यह सुनिश्चित करने के लिए कि वे सजातीय हैं, नमूनों को धीरे से लेकिन अच्छी तरह मिलाएं।जैसा कि परिणाम अनुभाग में वर्णित है, प्रत्येक घटक की सांद्रता प्रयोग दर प्रयोग भिन्न होती है।जब भी प्रयोग की अवधि 4 घंटे से अधिक हो गई तो एज़ाइड का उपयोग 0.02% (w/v) की सांद्रता पर किया गया।एलएलपीएस नमूनों का उपयोग करके सभी विश्लेषणों के लिए, विश्लेषण से पहले मिश्रण को 5 मिनट के लिए संतुलित होने दें।प्रकाश प्रकीर्णन विश्लेषण के लिए, 150 μl नमूनों को गैर-बाध्यकारी 96-वेल माइक्रोप्लेट्स (µClear®, ब्लैक, एफ-बॉटम/चिमनी वेल, ग्रीनर बायो-वन, क्रेम्समुन्स्टर, ऑस्ट्रिया) पर लोड किया गया और चिपकने वाली फिल्म से ढक दिया गया।CLARIOstar प्लेट रीडर (BMG लैबटेक, ऑर्टनबर्ग, जर्मनी) में समाधान के केंद्र में 350 एनएम पर अवशोषण को मापकर एलएलपी की निगरानी की गई।प्रयोग 25°C पर तीन प्रतियों में किए गए, और त्रुटियों की गणना माध्य से मानक विचलन के रूप में की गई।पतला चरण नमूना सेंट्रीफ्यूजेशन और एसडीएस-पेज जेल विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया गया था, और पतला और केंद्रित चरणों में αS अंश विभिन्न एलएलपीएस समाधानों में निर्धारित किया गया था।1 μM AF488-लेबल αS युक्त 100 μl LLPS नमूना पूरी तरह से मिश्रण करके तैयार किया गया था, जिसके बाद 30 मिनट के लिए 9600×g पर सेंट्रीफ्यूजेशन किया गया था, जिसके बाद अवक्षेप आमतौर पर दिखाई देता था।सतह पर तैरनेवाला के शीर्ष 50 μl का उपयोग एसडीएस-पेज जेल का उपयोग करके प्रोटीन मात्रा का ठहराव के लिए किया गया था।जैल को केमीडॉक जेल इमेजिंग सिस्टम (बायो-रेड लेबोरेटरीज, हरक्यूलिस, सीए, यूएसए) का उपयोग करके एएफ 488 फिल्टर के साथ स्कैन किया गया था या कोमासी दाग ​​के साथ दाग दिया गया था और उपयुक्त फिल्टर के साथ देखा गया था।परिणामी बैंड का विश्लेषण ImageJ संस्करण 1.53i (राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, यूएसए) का उपयोग करके किया गया।समान परिणामों के साथ दो अलग-अलग प्रयोगों में प्रयोग दो प्रतियों में किए गए।
आमतौर पर, 150 μl नमूनों को गैर-बाध्यकारी 96-वेल माइक्रोप्लेट्स पर लागू किया गया था और लीका DMI6000B उल्टे माइक्रोस्कोप (लीका माइक्रोसिस्टम्स, वेट्ज़लर, जर्मनी) पर कमरे के तापमान पर देखा गया था।स्पॉट प्रयोगों के लिए, μ-स्लाइड एंजियोजेनेसिस प्लेट्स (इबिडी जीएमबीएच, ग्रैफेलफिंग, जर्मनी) या 96-वेल पॉलीस्टीरिन माइक्रोप्लेट्स (कॉर्निंग कोस्टार कॉर्प, एक्टन, मैसाचुसेट्स) का भी उपयोग किया गया था।EL6000 हैलोजन या मरकरी मेटल हैलाइड लैंप का उपयोग रोशनी स्रोतों (क्रमशः बीएफ/डीआईसी और डब्ल्यूएफ इमेजिंग के लिए) के रूप में किया गया था।डब्ल्यूएफ माइक्रोस्कोपी के लिए, नमूने पर प्रकाश को केंद्रित करने और इसे एकत्र करने के लिए 40x आवर्धन वायु उद्देश्य (लेइका माइक्रोसिस्टम्स, जर्मनी) का उपयोग किया गया था।AF488 और ThT लेबल वाले नमूनों के लिए, मानक GFP फ़िल्टर सेट, उत्तेजना और उत्सर्जन बैंडपास फ़िल्टर, क्रमशः 460-500 एनएम और 512-542 एनएम बैंडपास फ़िल्टर, और एक 495 एनएम डाइक्रोइक दर्पण के साथ फ़िल्टर उत्तेजना और उत्सर्जन।Atto647N के साथ लेबल किए गए नमूनों के लिए, क्रमशः उत्तेजना और उत्सर्जन बैंडपास फिल्टर 628-40 एनएम और 692-40 एनएम के साथ Cy5 फिल्टर का एक मानक सेट और 660 एनएम डाइक्रोइक दर्पण का उपयोग किया गया था।बीएफ और डीआईसी माइक्रोस्कोपी के लिए, समान परावर्तित प्रकाश संग्रह उद्देश्य का उपयोग करें।एकत्रित प्रकाश को Leica DFC7000 CCD कैमरा (Leica माइक्रोसिस्टम्स, जर्मनी) पर रिकॉर्ड किया गया था।बीएफ और डीआईसी माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए एक्सपोज़र समय 50 एमएस और डब्ल्यूएफ माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए 20-100 एमएस था।तुलना के लिए, ThT के साथ सभी प्रयोगों का एक्सपोज़र समय 100 एमएस था।बूंदों के सहसंयोजन को देखने के लिए टाइम-लैप्स प्रयोग किए गए, जिसमें हर 100 एमएस में कई मिनटों तक छवियां एकत्र की गईं।छवि विश्लेषण के लिए ImageJ (NIH, USA) का उपयोग किया गया था।समान परिणामों के साथ प्रयोग तीन प्रतियों में किए गए।
कोलोकलाइज़ेशन प्रयोगों, FRAP और 3D पुनर्निर्माण के लिए, छवियों को ZEN 2 ब्लू संस्करण (कार्ल ज़ीस एजी, ओबेरकोचेन, जर्मनी) का उपयोग करके ज़ीस एलएसएम 880 उल्टे कन्फोकल माइक्रोस्कोप पर प्राप्त किया गया था।50 μl के नमूने μ-स्लाइड एंजियोजेनेसिस पेट्री डिश (इबिडी जीएमबीएच, ग्रोफेलिंग, जर्मनी) पर लागू किए गए, एक हाइड्रोफिलिक पॉलिमर (ibiTreat) के साथ इलाज किया गया और 63× तेल विसर्जन उद्देश्य (प्लान-एपोक्रोमैट 63×/एनए 1.4 तेल) में लगाया गया। डीआईसी पर)।470-600 एनएम, 493-628 एनएम की उत्तेजना और उत्सर्जन का पता लगाने वाली विंडो के लिए 0.26 µm/पिक्सेल के रिज़ॉल्यूशन और 8 µs/पिक्सेल के एक्सपोज़र समय के साथ 458 एनएम, 488 एनएम, और 633 एनएम आर्गन लेजर लाइनों का उपयोग करके छवियां प्राप्त की गईं। और 638-755 एनएम का उपयोग क्रमशः ThT, AF488 और Atto647N को देखने के लिए किया गया था।FRAP प्रयोगों के लिए, प्रत्येक नमूने की टाइम-लैप्स फोटोग्राफी 1 फ्रेम प्रति सेकंड पर रिकॉर्ड की गई थी।समान परिणामों के साथ कमरे के तापमान पर तीन प्रतियों में प्रयोग किए गए।सभी छवियों का विश्लेषण ज़ेन 2 ब्लू संस्करण सॉफ़्टवेयर (कार्ल ज़ीस एजी, ओबेरकोचेन, जर्मनी) का उपयोग करके किया गया था।FRAP वक्रों को सामान्यीकृत किया गया, प्लॉट किया गया और ओरिजिनप्रो 9.1 का उपयोग करके ज़ेन 2 का उपयोग करके छवियों से निकाले गए तीव्रता/समय डेटा के लिए फिट किया गया।पुनर्प्राप्ति वक्रों को अधिग्रहण ब्लीचिंग प्रभाव के लिए एक अतिरिक्त घातीय शब्द के साथ आणविक प्रसार के लिए एक मोनो-एक्सपोनेंशियल मॉडल में फिट किया गया था।फिर हमने कांग एट अल के समीकरण के अनुसार नाममात्र ब्लीचिंग त्रिज्या और पहले से निर्धारित पुनर्प्राप्ति आधे जीवन का उपयोग करके डी की गणना की।5 35 दिखाया गया।
αS के एकल सिस्टीन वेरिएंट को 24 (TEMPOL-24-αS) और 122 (TEMPOL-122-αS) पदों पर 4-हाइड्रॉक्सी-2,2,6,6-टेट्रामिथाइलपाइपरिडीन-एन-ऑक्सिल (TEMPOL) के साथ संश्लेषित किया गया था। क्रमश।ईपीआर प्रयोगों के लिए स्पिन लेबलिंग, αS सांद्रता 100 μM पर सेट की गई थी और PEG सांद्रता 15% (w/v) थी।विभिन्न एकत्रीकरण स्थितियों के लिए, αS:pLK अनुपात 1:10 था, जबकि αS:ΔNt-Tau और αS:Tau441 अनुपात 1:1 पर बनाए रखा गया था।भीड़ की अनुपस्थिति में बाइंडिंग अनुमापन प्रयोगों के लिए, TEMPOL-122-αS को 50 μM पर बनाए रखा गया था और प्रत्येक स्थिति को अलग से तैयार करते हुए, बढ़ती सांद्रता पर पॉलीकेशन का अनुमापन किया गया था।सीडब्ल्यू-ईपीआर माप ~9.7 गीगाहर्ट्ज़ की माइक्रोवेव (एसएचएफ) आवृत्ति पर संचालित होने वाले ब्रूकर ईआर4118 एसपीटी-एन1 रेज़ोनेटर से लैस ब्रुकर एलेक्सिस ई580 एक्स-बैंड स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करके किया गया था।तापमान 25°C पर सेट किया गया और तरल नाइट्रोजन क्रायोस्टेट द्वारा नियंत्रित किया गया।स्पेक्ट्रा 4 मेगावाट की मेगावाट शक्ति, 0.1 एमटी के मॉड्यूलेशन आयाम और 100 किलोहर्ट्ज़ की मॉड्यूलेशन आवृत्ति पर असंतृप्त परिस्थितियों में प्राप्त किए गए थे।Tau441 या ΔNt-Tau (मूल प्रोटीन समाधान में मौजूद) वाले नमूनों में कम करने वाले एजेंटों की अवशिष्ट सांद्रता के कारण नमूनों के बीच स्पिन सांद्रता में अंतर और संभावित स्पिन कमी से बचने के लिए वर्णक्रमीय तीव्रता को सामान्य किया गया था।जी के दिए गए मान मैटलैब®67 में कार्यान्वित ईज़ीस्पिन सॉफ़्टवेयर (v. 6.0.0-dev.34) का उपयोग करके किए गए ईपीआर वर्णक्रमीय मॉडलिंग के परिणामस्वरूप प्राप्त किए गए थे।डेटा को मॉडल करने के लिए एक/दो घटक आइसोट्रोपिक मॉडल का उपयोग किया गया था।सभी संकेतों को सामान्य करने के बाद, प्रत्येक सिमुलेशन को संबंधित प्रयोगात्मक स्पेक्ट्रम से घटाकर अवशेषों की गणना की गई।बाइंडिंग अनुमापन विश्लेषण के लिए, सामान्यीकृत ईपीआर स्पेक्ट्रम (III/III) के दूसरे बैंड के तीसरे बैंड की सापेक्ष तीव्रता का उपयोग αS के लिए पॉलीकेशन के बाइंडिंग की निगरानी के लिए किया गया था।पृथक्करण स्थिरांक (केडी) का अनुमान लगाने के लिए, परिणामी वक्र को एन समान और स्वतंत्र बाध्यकारी साइटों को मानते हुए एक अनुमानित मॉडल में फिट किया गया था।
क्रायोप्रोब और जेड-ग्रेडिएंट से लैस ब्रूकर नियो 800 मेगाहर्ट्ज (1H) एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करके एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रयोग किए गए।सभी प्रयोग 130-207 µM αS और संबंधित αS/ΔNt-Tau और pLK समकक्षों का उपयोग 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7.4 में किए गए और 15°C पर किए गए।एनएमआर द्वारा एलपीएस की निगरानी के लिए, पूर्व-मिश्रित नमूनों में 10% पीईजी जोड़ा गया था।रासायनिक बदलाव गड़बड़ी प्लॉट (छवि 1 बी) औसत 1H और 15N रासायनिक बदलाव दिखाता है।αS 2D1H-15N HSQC स्पेक्ट्रा को पिछले असाइनमेंट (BMRB प्रविष्टि #25227) के आधार पर सौंपा गया था और HNCA, HNCO और CBCAcoNH के 3D स्पेक्ट्रा की रिकॉर्डिंग और विश्लेषण करके इसकी पुष्टि की गई थी।13Cα और 13Cβ रासायनिक बदलावों की गणना शुद्ध यादृच्छिक कुंडल संरचना 68 (पूरक चित्रा 5 सी) में αS रासायनिक बदलावों की तुलना में माध्यमिक संरचना प्रवृत्तियों में संभावित परिवर्तनों को मापने के लिए ΔNt-Tau या pLK की उपस्थिति में की गई थी।R1ρ दरों को 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 और 800 एमएस की देरी के साथ hsqctretf3gpsi प्रयोगों (ब्रूकर लाइब्रेरी से प्राप्त) को रिकॉर्ड करके मापा गया था, और घातीय कार्यों को अलग-अलग चरम तीव्रता देरी पर समायोजित किया गया था R1ρ और इसकी प्रायोगिक अनिश्चितता को निर्धारित करने का समय।
दो-रंग समय-समाधान प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्रयोग एक समय-सहसंबद्ध एकल फोटॉन गिनती (TCSPC) डिवाइस के साथ एक वाणिज्यिक समय-समाधान MT200 प्रतिदीप्ति कन्फोकल माइक्रोस्कोप (पिकोक्वांट, बर्लिन, जर्मनी) पर किए गए थे।लेजर डायोड हेड का उपयोग स्पंदित इंटरलीव्ड उत्तेजना (पीआईई) के लिए किया जाता है, बीम एकल मोड वेवगाइड से गुजरता है और डाइक्रोइक दर्पण के बाद मापी गई 481 एनएम और 637 एनएम लेजर लाइनों के लिए 10 से 100 एनडब्ल्यू की लेजर शक्ति पर ट्यून किया जाता है।यह फोटॉन अलियासिंग, फोटोब्लीचिंग और संतृप्ति के प्रभावों से बचते हुए एक इष्टतम फोटॉन गिनती दर सुनिश्चित करता है।μ-स्लाइड एंजियोजेनेसिस कवरस्लिप्स या प्लेट्स (इबिडी जीएमबीएच, ग्रैफ़ेल्फ़िंग, जर्मनी) को एक सुधारात्मक कॉलर (ओलंपस लाइफ साइंसेज, वाल्थम, यूएसए) के साथ सुपर एपोक्रोमैट 60x एनए 1.2 लेंस पर सीधे विसर्जन पानी में रखा गया था।एक 488/640 एनएम डाइक्रोइक दर्पण (सेमरॉक, लेक फ़ॉरेस्ट, आईएल, यूएसए) का उपयोग मुख्य बीम स्प्लिटर के रूप में किया गया था।अनफोकस्ड विकिरण को 50 माइक्रोन के व्यास वाले एक छेद द्वारा अवरुद्ध किया जाता है, फिर केंद्रित विकिरण को 50/50 बीम स्प्लिटर द्वारा 2 पहचान पथों में विभाजित किया जाता है।डिटेक्टर के सामने हरे रंग (एएफ488) के लिए बैंडपास उत्सर्जन फिल्टर (सेमरॉक, लेक फॉरेस्ट, आईएल, यूएसए) 520/35 और लाल रंग (एटो647एन) के लिए 690/70 का उपयोग किया गया था।सिंगल-फोटॉन हिमस्खलन डायोड (एसपीएडी) (माइक्रो फोटॉन डिवाइसेस, बोल्ज़ानो, इटली) का उपयोग डिटेक्टरों के रूप में किया गया था।डेटा संग्रह और विश्लेषण दोनों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सिम्फोटाइम64 सॉफ़्टवेयर (पिकोक्वांट जीएमबीएच, बर्लिन, जर्मनी) का उपयोग करके किए गए थे।
एलएलपीएस नमूनों के पचास माइक्रोलीटर को μ-स्लाइड एंजियोजेनेसिस कुओं (इबिडी जीएमबीएच, ग्रैफेलिंग, जर्मनी) पर लागू किया गया था।परिणामी छवियों को निलंबित बूंदों के लिए इष्टतम उद्देश्य कार्य दूरी के लिए कुएं के तल से 20 µm ऊपर और कम से कम 0.25 µm/पिक्सेल के अक्षीय रिज़ॉल्यूशन और 400 µs/पिक्सेल के विलंब समय के साथ राफ्ट और डॉट्स के लिए ~1 µm पर केंद्रित किया जाता है।प्रत्येक चैनल के लिए औसत पृष्ठभूमि सिग्नल तीव्रता (पीबीजी, माध्य + 2σ) के आधार पर तीव्रता सीमा लागू करके डेटा का चयन करें ताकि बिखरे हुए चरण से किसी भी संभावित उत्पत्ति को फ़िल्टर करते हुए केवल तरल प्रोटीन बूंदों, राफ्ट या स्पॉट का चयन किया जा सके।प्रत्येक चैनल की प्रत्येक प्रजाति (τ) के जीवनकाल का विश्लेषण करने के लिए (हरा, AF488 के लिए "g" और Atto647N के लिए लाल, "r"), हमने बूंदों, राफ्ट या स्पॉट वाले रुचि के क्षेत्रों (ROI) का चयन किया (पूरक चित्र 1) ).8बी) और टेल-फिट विश्लेषण और दो-घटक क्षय मॉडल का उपयोग करके प्रत्येक चैनल में उनके जीवनकाल क्षय (बूंदों, राफ्ट या स्पॉट के लिए क्रमशः τD, τR और τP, अनुपूरक चित्र 8सी देखें) को फिट करके उन्हें प्राप्त किया।औसत τ से τ .मल्टी-एक्सपोनेंशियल फिट के लिए बहुत कम फोटॉन उत्पन्न करने वाले आरओआई को विश्लेषण से बाहर रखा गया था।इस्तेमाल किया गया कटऑफ राफ्ट और डॉट्स के लिए <104 फोटॉन और बूंदों के लिए 103 था।बूंदों की सीमा कम होती है क्योंकि उच्च तीव्रता मूल्यों के साथ क्षय वक्र प्राप्त करना मुश्किल होता है, क्योंकि छवि क्षेत्र में बूंदें आमतौर पर छोटी और कम संख्या में होती हैं।फोटॉन संचय सीमा (500 से अधिक गणना/पिक्सेल पर सेट) से अधिक फोटॉन गणना वाले आरओआई को भी विश्लेषण के लिए छोड़ दिया गया।सभी तीव्रता क्षय के लिए समान बनाए रखते हुए न्यूनतम आईआरएफ हस्तक्षेप सुनिश्चित करने के लिए सेवा जीवन की शुरुआत से अधिकतम 90% (क्षय की अधिकतम तीव्रता के थोड़ा बाद) पर तीव्रता के साथ ब्याज के क्षेत्र से प्राप्त तीव्रता क्षय वक्र का मिलान करें। सेटिंग्स सापेक्ष समय विंडो का विश्लेषण राफ्ट और स्पॉट के लिए 25 से 50 आरओआई और बूंदों के लिए 15-25 आरओआई का किया गया, कम से कम 3 स्वतंत्र प्रयोगों से रिकॉर्ड की गई 4 से अधिक प्रतिकृति से चुनी गई छवियां।प्रजातियों के बीच या कोएसर्वेट प्रणालियों के बीच सांख्यिकीय अंतर का मूल्यांकन करने के लिए दो-पूंछ वाले टी-परीक्षणों का उपयोग किया गया है।जीवनकाल (τ) के पिक्सेल-दर-पिक्सेल विश्लेषण के लिए, प्रत्येक चैनल के लिए क्षेत्र पर जीवनकाल के कुल क्षीणन की गणना की गई और 2/3-घटक घातीय क्षीणन मॉडल का अनुमान लगाया गया।प्रत्येक पिक्सेल के लिए जीवनकाल क्षीणन को पहले से गणना किए गए τ मानों का उपयोग करके फिट किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप एक छद्म रंग FLIM फिट छवि प्राप्त हुई।टेल-फिट जीवनकाल सीमा एक ही चैनल की सभी छवियों में समान थी, और प्रत्येक क्षय ने एक विश्वसनीय फिट प्रदान करने के लिए पर्याप्त फोटॉन का उत्पादन किया।FRET विश्लेषण के लिए, 100 फोटॉनों की कम तीव्रता सीमा को लागू करके पिक्सेल का चयन किया गया, जिसका औसत 11 फोटॉनों का पृष्ठभूमि सिग्नल (FBG) था।प्रत्येक चैनल की प्रतिदीप्ति तीव्रता को प्रयोगात्मक रूप से निर्धारित सुधार कारकों द्वारा ठीक किया गया था: 69 वर्णक्रमीय क्रॉसस्टॉक α 0.004 था, प्रत्यक्ष उत्तेजना β 0.0305 था, पता लगाने की दक्षता γ 0.517 थी।पिक्सेल स्तर पर FRET दक्षता की गणना निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके की जाती है:
जहां एफडीडी दाता (हरा) चैनल में देखी गई प्रतिदीप्ति तीव्रता है, एफडीए अप्रत्यक्ष उत्तेजना के तहत स्वीकर्ता (लाल) चैनल में देखी गई प्रतिदीप्ति तीव्रता है, और एफएए प्रत्यक्ष उत्तेजना के तहत स्वीकर्ता (लाल) चैनल में देखी गई प्रतिदीप्ति तीव्रता है ( पाई).चैनल में प्रतिदीप्ति तीव्रता स्पंदन देखे जाते हैं)।
25 µM बिना लेबल वाले मोनोमेरिक Tau441 (25 µM αS के साथ या बिना) वाले LLPS प्रतिक्रिया समाधानों के 100 μl को LLPS बफर (ऊपर के अनुसार पूरक) में चिपकने वाली पन्नी कोटिंग और बूंद गठन के साथ गैर-बाध्यकारी 96-अच्छी माइक्रोप्लेट्स पर रखें, जिसके बाद WF माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच की गई थी संतुलन.10 मिनट के भीतर.कमरे के तापमान पर 48 घंटों के ऊष्मायन के बाद, प्रोटीन राफ्ट और धब्बों की उपस्थिति की पुष्टि की गई।फिर कुओं से राफ्ट के ऊपर से तरल को सावधानीपूर्वक हटा दें, फिर 50 एल पृथक्करण बफर (10 मिमी एचईपीईएस, पीएच 7.4, 1 एम NaCl, 1 मिमी डीटीटी) जोड़ें और 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।उच्च नमक सांद्रता यह सुनिश्चित करती है कि एलएलपीएस अवशिष्ट पीईजी के कारण दोहराया नहीं जाएगा, और केवल इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन द्वारा गठित संभावित प्रोटीन असेंबली को अलग कर दिया जाएगा।फिर कुएं के निचले हिस्से को माइक्रोपिपेट टिप से सावधानीपूर्वक खुरच दिया गया और परिणामी घोल को एक खाली अवलोकन कुएं में स्थानांतरित कर दिया गया।1 घंटे के लिए 50 μM ThT के साथ नमूनों के ऊष्मायन के बाद, WF माइक्रोस्कोपी द्वारा पृथक धब्बों की उपस्थिति की जाँच की गई।7 दिनों के लिए एक कक्षीय शेकर पर पीएच 7.4, 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.01% सोडियम एजाइड और 200 आरपीएम के साथ पीबीएस में 70-µM αS समाधान के 300 μl को इनक्यूबेट करके सोनिकेटेड αS फाइब्रिल तैयार करें।फिर समाधान को 30 मिनट के लिए 9600×जी पर सेंट्रीफ्यूज किया गया, गोली को पीबीएस पीएच 7.4 में फिर से निलंबित कर दिया गया और सोनिकेट किया गया (1 मिनट, 50% चक्र, वाइब्रा-सेल वीसी130 सोनिकेटर, सोनिक, न्यूटन, यूएसए में 80% आयाम) फाइब्रिल नमूने छोटे तंतुओं के अपेक्षाकृत समान आकार वितरण के साथ।
FCS/FCCS विश्लेषण और दो-रंग संयोग का पता लगाने (TCCD) को PIE मोड का उपयोग करके FLIM-FRET माइक्रोस्कोपी प्रयोगों के लिए उपयोग किए जाने वाले उसी MT200 टाइम-रिज़ॉल्यूशन वाले फ्लोरोसेंट कन्फोकल माइक्रोस्कोप (पिको-क्वांट, बर्लिन, जर्मनी) पर किया गया था।इन प्रयोगों के लिए लेजर शक्ति को 6.0 µW (481 एनएम) और 6.2 µW (637 एनएम) तक जोड़ा गया था।इष्टतम गिनती दर प्राप्त करने और फोटोब्लीचिंग और संतृप्ति से बचने के दौरान उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोफोरस के जोड़े के लिए समान चमक उत्पन्न करने के लिए इन लेजर शक्तियों के संयोजन को चुना गया था।डेटा संग्रह और विश्लेषण दोनों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सिम्फोटाइम64 संस्करण 2.3 सॉफ़्टवेयर (पिकोक्वांट, बर्लिन, जर्मनी) का उपयोग करके किए गए थे।
एलएलपीएस का उपयोग करके प्राप्त पृथक αS/ताऊ समुच्चय के नमूनों को आइसोलेशन बफर में उचित मोनोमोलेक्युलर एकाग्रता (आमतौर पर 1: 500 कमजोर पड़ने) में पतला किया जाता है, क्योंकि समुच्चय पहले से ही कम सांद्रता पर होते हैं जब कोएसर्वेट नमूनों से अलग किया जाता है।नमूनों को सीधे 1 मिलीग्राम/एमएल की सांद्रता पर बीएसए समाधान के साथ पहले से लेपित कवरस्लिप्स (कॉर्निंग, यूएसए) पर लागू किया गया था।
हरे और लाल चैनलों में PIE-smFRET विश्लेषण के लिए, मोनोमेरिक घटनाओं के कारण कम तीव्रता वाले संकेतों को फ़िल्टर करने के लिए 25 फोटॉन की कम तीव्रता सीमा लागू की गई थी (ध्यान दें कि मोनोमर्स पृथक समुच्चय की तुलना में एकत्रित नमूनों से अधिक हैं)।विश्लेषण के लिए विशेष रूप से समुच्चय का चयन करने के लिए इस सीमा की गणना शुद्ध मोनोमर नमूनों के विश्लेषण से प्राप्त मोनोमेरिक αS की औसत तीव्रता के पांच गुना के रूप में की गई थी।पीआईई ड्राइव सर्किट ने, टीएससीपीसी डेटा अधिग्रहण के साथ मिलकर, लाइफटाइम वेटिंग फिल्टर के अनुप्रयोग को सक्षम किया है जो पृष्ठभूमि और वर्णक्रमीय क्रॉसस्टॉक को खत्म करने में मदद करता है।उपरोक्त थ्रेशोल्ड का उपयोग करके चयनित फ्लेयर तीव्रता को केवल-बफर नमूनों की घटना बनाम तीव्रता/बिन के हिस्टोग्राम से निर्धारित औसत पृष्ठभूमि सिग्नल का उपयोग करके ठीक किया गया था।बड़े समुच्चय से जुड़े विस्फोट आमतौर पर टाइम ट्रेस (1 एमएस पर सेट) में कई लगातार डिब्बे पर कब्जा कर लेते हैं।इन मामलों में, अधिकतम ताकत वाला बिन चुना गया।FRET और स्टोइकोमेट्रिक विश्लेषण के लिए, सैद्धांतिक रूप से निर्धारित गामा कारक γ (0.517) का उपयोग किया गया था।प्रयुक्त उत्तेजना लेजर शक्ति पर स्पेक्ट्रल क्रॉसस्टॉक और प्रत्यक्ष उत्तेजना योगदान नगण्य (प्रयोगात्मक रूप से निर्धारित) हैं।एक विस्फोट में FRET की दक्षता और स्टोइकोमेट्री की गणना निम्नानुसार की जाती है।