347 स्टेनलेस स्टील कुंडलित ट्यूबिंग रासायनिक घटक, क्रॉस-लिंक्ड मास स्पेक्ट्रोमेट्री (सीएलएमएस) का उपयोग करके उपन्यास इंटरफेरॉन-उत्तरदायी मानव ल्यूकोसाइट एंटीजन-ए (एचएलए-ए) चैपरोन प्रोटीन की पहचान

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उत्पाद वर्णन

स्टेनलेस स्टील 347L कॉइल ट्यूब, स्टील ग्रेड: SS347L

इंटरफेरॉन सिग्नलिंग प्रणाली पर्यावरण से रोगजनक और आंतरिक रोग संबंधी संकेतों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए एक मजबूत साइटोकिन प्रतिक्रिया उत्पन्न करती है, जिसके परिणामस्वरूप इंटरफेरॉन-प्रेरित प्रोटीन के सबसेट शामिल होते हैं।हमने इंटरफेरॉन-प्रेरित प्रोटीन के क्षेत्र में नए प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का पता लगाने के लिए डीएसएस-मध्यस्थता क्रॉस-लिंक मास स्पेक्ट्रोमेट्री (सीएलएमएस) लागू किया।अपेक्षित इंटरफेरॉन-इंड्यूसिबल प्रोटीन के अलावा, हमने एमएक्स1, यूएसपी18, ओएएस3 और एसटीएटी1 जैसे कैनोनिकल इंटरफेरॉन-इंड्यूसिबल प्रोटीन के नए इंटरमॉलिक्युलर और इंट्रामोल्युलर क्रॉस-लिंक्ड एडक्ट्स की भी पहचान की।हमने सह-इम्युनोप्रेग्रेशन का उपयोग करके एचएलए-ए प्रोटीन (एच2बीएफएस-एचएलए-ए-एचएमजीए1) द्वारा गठित इंटरफेरॉन-इंड्यूसिबल प्रोटीन नेटवर्क के एक उपन्यास सेट के ऑर्थोगोनल सत्यापन और आणविक गतिशीलता मॉडलिंग का उपयोग करके उनके आगे के अध्ययन पर ध्यान केंद्रित किया।प्रोटीन कॉम्प्लेक्स की गठनात्मक गतिशीलता के मॉडलिंग से कई इंटरैक्शन साइटों का पता चला जो सीएलएमएस निष्कर्षों में पहचाने गए इंटरैक्शन को दर्शाते हैं।साथ में, हम इंटरफेरॉन से प्रेरित नए सिग्नलिंग कॉम्प्लेक्स की पहचान करने के लिए सीएलएमएस का एक पायलट अध्ययन प्रस्तुत करते हैं, और ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में प्रोटीन इंटरैक्शन की नई गतिशीलता की पहचान करने के लिए सीएलएमएस के व्यापक उपयोग के लिए तत्पर हैं।
एक अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया शुरू होने से पहले, मेजबान की जन्मजात रक्षा प्रणाली इंटरफेरॉन (आईएफएन) नामक स्रावित अल्फा-हेलिकल साइटोकिन्स के एक परिवार द्वारा मध्यस्थता वाली रोगाणुरोधी प्रतिक्रिया को माउंट करती है।प्रकार I IFN वर्ग IFNα और IFNβ सेलुलर प्रतिक्रियाओं को सक्रिय करते हैं, जिनमें एंटीवायरल, प्रॉपोपोटिक, प्रिनफ्लेमेटरी और एंटीप्रोलिफेरेटिव अवस्थाएं शामिल हैं।मनुष्यों में, IFNα के 13 उपप्रकार ज्ञात हैं, सभी गुणसूत्र 91 पर क्लस्टर किए गए हैं। आश्चर्यजनक रूप से, नैदानिक ​​​​उपयोग के लिए केवल IFNα2 का अध्ययन किया गया है।हाल ही में, IFNα के अन्य उपप्रकारों पर शोध पर विशेष ध्यान दिया गया है।एक हालिया अध्ययन से पता चला है कि IFNα14 विहित IFNα2 उपप्रकार की तुलना में HBV2 और HIV-13,4 प्रतिकृति को प्रतिबंधित करने में सबसे प्रभावी आइसोफॉर्म में से एक है।
यह स्थापित किया गया है कि सक्रिय प्रकार I इंटरफेरॉन रिसेप्टर कॉम्प्लेक्स (IFNAR1 और IFNAR2) जानूस किनेसेस TYK2 और JAK15,6 द्वारा मध्यस्थता वाले सिग्नल ट्रांसडक्शन कैस्केड को ट्रिगर करते हैं।ये जानूस किनेसेस फॉस्फोराइलेट सिग्नल ट्रांसड्यूसर और ट्रांसक्रिप्शनल प्रोटीन एक्टिवेटर (STAT1 और STAT2) टायरोसिन अवशेषों पर SH2 डोमेन-मध्यस्थ हेटेरोडिमराइजेशन6 शुरू करने के लिए।इसके बाद, IRF9 STAT हेटेरोडिमर्स को IFN-उत्तेजित फैक्टर 3 जीन (ISGF3) का एक ट्रिमेरिक कॉम्प्लेक्स बनाने के लिए बांधता है, जो नाभिक में स्थानांतरित होता है और 2000 से अधिक इंटरफेरॉन-उत्तेजित जीन (ISG)5,6,7,8 के प्रतिलेखन को प्रेरित करता है।
आईएसजी जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली की रीढ़ बनते हैं, खासकर वायरल हमले के जवाब में।वायरल संक्रमण के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति के रूप में, कोशिकाएं तेजी से जैविक गतिविधियों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ सेलुलर प्रोटीन की व्यापक बातचीत को तैनात करती हैं।इन प्रोटीनों में पैटर्न पहचान रिसेप्टर्स, सिग्नलिंग अणु, प्रतिलेखन कारक और प्रत्यक्ष एंटीवायरल कार्यों वाले प्रोटीन, साथ ही प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के नकारात्मक नियामक शामिल हैं।आईएसजी गतिविधि पर अधिकांश जानकारी ओवरएक्सप्रेशन स्क्रीन10,11 या जीन साइलेंसिंग तकनीक (एसआईआरएनए, आरएनएआई और सीआरआईएसपीआर)12,13 का उपयोग करके कार्यात्मक स्क्रीन से आती है जिसमें व्यक्तिगत आईएसजी को व्यक्त या बाधित किया जाता है और उनकी गतिविधि का विभिन्न वायरस पर परीक्षण किया जाता है।हालाँकि इन अध्ययनों ने व्यक्तिगत आईएसजी के एंटीवायरल गुणों को निर्धारित किया है, प्रत्येक आईएसजी के अंतर्निहित आणविक तंत्र काफी हद तक अज्ञात हैं।यह आम तौर पर स्वीकार किया जाता है कि कई प्रोटीन पूर्ण गतिविधि सुनिश्चित करने के लिए एक या अधिक साइटोकिन्स के साथ बातचीत करते हैं, इसलिए या तो आईएसजी सीधे बातचीत करते हैं या उनकी बातचीत सेलुलर प्रोटीन द्वारा मध्यस्थ होती है।उदाहरण के लिए, एक हालिया फोटोक्रॉसलिंक्ड प्रोटिओमिक्स अध्ययन ने ATPase VCP/p97 को एक प्रमुख IFITM3 इंटरेक्शन पार्टनर के रूप में पहचाना, जिसके निषेध से वायरल कणों 14 के साथ IFITM3 के लाइसोसोमल सॉर्टिंग, टर्नओवर और कोट्रांसपोर्ट में दोष होता है।इम्युनोप्रेसेपिटेशन का उपयोग करते हुए, हमने VAPA, एक पुटिका-संबंधित प्रोटीन, को IFITM1/2/3 के साथ एक इंटरेक्शन पार्टनर के रूप में पहचाना, जो कोलेस्ट्रॉल-मध्यस्थ वायरल परिपक्वता में मध्यस्थता करता है, और यीस्ट टू-हाइब्रिड सिस्टम का उपयोग करके एक अन्य अध्ययन द्वारा इसकी पुष्टि की गई थी।वैज्ञानिक समर्थन 15 , 16 .
संक्रमण और घातक परिवर्तन के दमन में शामिल एक मौलिक जैविक प्रक्रिया एंटीजन प्रस्तुति है, जो प्रमुख हिस्टोकम्पैटिबिलिटी कॉम्प्लेक्स (एमएचसी) अणुओं द्वारा मध्यस्थ होती है।क्लीव्ड, समय से पहले समाप्त या मिसफोल्डेड प्रोटीन से पेप्टाइड्स (8-12 अमीनो एसिड लंबे) को एमएचसी-आई हेटेरोडिमर (एमएचसी-आई भारी और हल्की श्रृंखलाओं से युक्त, जिसे β-2-माइक्रोग्लोबुलिन कहा जाता है; β2M) 17,18 में लोड किया जाता है।परिणामी स्थिर एमएचसी-आई ट्रिमर्स को कोशिका की सतह पर ले जाया जाता है, जहां वे सीडी8+ टी कोशिकाओं (साइटोटॉक्सिक टी कोशिकाओं)17 में इंट्रासेल्युलर पेप्टाइड्स पेश करते हैं।टी कोशिकाएं इन रोगजनकों और ट्यूमर-विशिष्ट एंटीजन ले जाने वाली कोशिकाओं को पहचानती हैं और नष्ट कर देती हैं।नतीजतन, रोगज़नक़ और ट्यूमर कोशिकाएं अक्सर प्रतिरक्षा निगरानी से बचने के लिए एंटीजन प्रस्तुति प्रक्रिया को दबा देती हैं।इसके अलावा, MHC-I को 40-90% मानव ट्यूमर में डाउनरेगुलेट किया जाता है और यह अक्सर खराब पूर्वानुमान19 से जुड़ा होता है।
रोगज़नक़ों पर प्रतिक्रिया करने में शामिल जीनों को आराम की स्थिति और सक्रिय प्रतिलेखन की स्थिति के बीच जल्दी से स्विच करना होगा।इसलिए, कई सेलुलर प्रोटीनों को कम समय में उच्च आईएफएन मांग की प्रतिक्रिया में शामिल होने की परिकल्पना की गई है, जिसमें प्रमोटर क्रोमैटिन 20,21 का रीमॉडलिंग और संशोधन शामिल है।अधिकांश अध्ययनों ने आईएफएन की उपस्थिति में व्यक्तिगत आईएसजी प्रोटीन भागीदारों की पहचान पर ध्यान केंद्रित किया है।मॉडल सेल सिस्टम में कई प्रोटिओमिक और ट्रांसक्रिप्टोमिक अध्ययनों ने सेलुलर परिदृश्य पर आईएफएन के प्रभाव को स्पष्ट किया है।हालाँकि, इंटरफेरॉन से प्रेरित गतिशीलता की बढ़ती समझ के बावजूद, हम अभी भी आईएसजी की भागीदारी के बारे में बहुत कम जानते हैं।इंटरफेरॉन सिग्नलिंग की जटिलता और समय-निर्भर गतिशीलता पर विचार करते समय, दो प्रश्न उठते हैं: (i) क्या तेज़ सिग्नलिंग में शामिल मल्टीप्रोटीन कॉम्प्लेक्स को स्थिर करना और फंसाना संभव है, और (ii) क्या इन इंटरैक्शन को 3 डी स्पेस में मैप किया जा सकता है?
इन मुद्दों को संबोधित करने के लिए, हमने IFNα-प्रेरित प्रोटीन इंटरेक्शन नेटवर्क और इसकी गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री (सीएलएमएस) के साथ मिलकर डिसुसिनिमाइड सबरेट-मध्यस्थता वाले रासायनिक क्रॉस-लिंकिंग (डीएसएस) को लागू किया।डीएसएस विवो में प्रोटीन और/या प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के समीपस्थ अवशेषों के बीच सहसंयोजक बंधन जोड़ता है।बाद के एमएस विश्लेषण से विशिष्ट क्रॉसलिंकिंग साइटों का पता चलता है जो एक विशेष प्रोटीन के भीतर क्षेत्रों की स्थानिक निकटता को दर्शाते हैं, जिन्हें आंतरिक लिंकेज कहा जाता है, या प्रोटीन परिसरों में सबयूनिट, जिन्हें अंतर्संबंध कहा जाता है।इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, हमने कई नए प्रोटीन-प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के साथ-साथ इंटरफेरॉन-प्रेरित मल्टीप्रोटीन इंटरैक्शन नेटवर्क की पहचान की है।इन नए इंटरैक्शन के सबसेट का आगे परीक्षण करके, हम प्रदर्शित करते हैं कि H2BFS (H2B हिस्टोन-प्रकार FS; इसके बाद H2B के रूप में संदर्भित) और MDN1 HLA-A के लिए बाध्यकारी भागीदार के रूप में कार्य करते हैं।
फ़्लो-1 कोशिकाएं एसोफेजियल एडेनोकार्सिनोमा के सबसे प्रसिद्ध इन विट्रो मॉडल में से एक हैं क्योंकि वे एसोफेजियल ट्यूमर की प्रमुख विशेषताओं की नकल करते हैं।हालाँकि, सभी ट्यूमर इम्युनोजेनिक नहीं होते हैं, और यह निर्धारित करने के लिए कि क्या फ़्लो-1 कोशिकाएं इंटरफेरॉन उपचार का जवाब देती हैं, हमने फ़्लो-1 कोशिकाओं का 72 घंटों के लिए 10 एनजी/एमएल IFNα के साथ इलाज किया।फ़्लो-1 कोशिकाओं ने पीएसटीएटी1 और आईआरएफ1 का प्रारंभिक प्रेरण दिखाया, जो उपचार के 2 घंटे बाद शुरू हुआ और 72 घंटों तक जारी रहा, आईआरएफ1 के स्थिर स्तर में समय-निर्भर कमी के साथ (चित्र 1ए)।ISGs (MX1, IFITM1, OAS1/2, और ISG15) को 6 घंटे के बाद दृढ़ता से प्रेरित पाया गया, जो IFNα (चित्र 1A) की क्लासिक मध्य और देर चरण प्रतिक्रियाओं की नकल करता है।साथ में, ये डेटा सुझाव देते हैं कि इस सेलुलर मॉडल का उपयोग इंटरफेरॉन प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।
IFNα उपचार के बाद फ़्लो-1 कोशिकाओं में विभेदक प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रतिक्रियाएँ।(ए) 2, 6, 24, 48 और 72 घंटों के लिए 10 एनजी/एमएल आईएफएनα से उपचारित फ़्लो-1 कोशिकाओं में प्रोटीन अभिव्यक्ति का संकेतित आईएसजी एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्युनोब्लॉट द्वारा विश्लेषण किया गया था।(बी) संकेतित समय और सांद्रता के लिए डीएसएस के साथ क्रॉस-लिंकिंग के बाद पूरे सेल अर्क के कूमैसी नीले दाग वाले एसडीएस-पेज जैल।(सी) प्रोटीन क्रॉस-लिंकिंग की डिग्री का आकलन करने के लिए समान नमूनों से पी53(डीओ-1) एंटीबॉडी के साथ प्रतिनिधि इम्युनोब्लॉट की जांच की गई।
स्वस्थानी प्रोटीन इंटरेक्शन परिदृश्य को पकड़ने के लिए, हमने डीएसएस का उपयोग किया, जो इसकी उच्च झिल्ली पारगम्यता और अपेक्षाकृत कम प्रतिक्रिया समय के कारण व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला क्रॉस-लिंकिंग एजेंट है।कम प्रतिक्रिया समय क्रॉसलिंक्ड प्रोटीन के बड़े समुच्चय के गठन को रोकने में मदद करता है, जिससे क्रॉसलिंकर की स्थिरता बनी रहती है।इष्टतम डीएसएस एकाग्रता निर्धारित करने और ओवर-क्रॉसलिंकिंग से बचने के लिए, हमने पहले क्रमशः 5, 10, 5 और 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को 5, 2.5 और 1 मिमी डीएसएस में उजागर किया, और कोमासी-सना हुआ एसडीएस-पेज द्वारा लाइसेट्स का विश्लेषण किया। (डाटा नहीं दिखाया गया) ।सेल लाइसेट्स सबसे कम सांद्रता और सबसे कम समय बिंदु पर अत्यधिक क्रॉस-लिंक्ड प्रतीत होते हैं।इसलिए, DSS को 5 मिनट में 1, 0.5 और 0.1 mM तक शीर्षक दिया गया (चित्र 1बी)।5 मिनट के लिए 0.5 एमएम डीएसएस के साथ इष्टतम क्रॉसलिंकिंग देखी गई, और इन स्थितियों को IFNα से उपचारित कोशिकाओं के लिए चुना गया था।इसके अलावा, चित्र 1सी प्रोटीन क्रॉस-लिंकिंग की डिग्री का आकलन करने के लिए पी53 (डीओ-1) एंटीबॉडी का उपयोग करके किया गया एक पश्चिमी धब्बा दिखाता है।
क्रॉसलिंकर जोड़ने से पहले फ़्लो-1 कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए 10 एनजी/एमएल IFNα के साथ इलाज किया गया था।क्रॉस-लिंक्ड कोशिकाओं को बाद में दो-चरण प्रोटियोलिसिस द्वारा लाइज़ किया गया और प्रोटीन को एफएएसपी (चित्र 2)24,25 द्वारा संसाधित किया गया।क्रॉस-लिंक्ड ट्राइप्टिक पेप्टाइड्स का विश्लेषण मास स्पेक्ट्रोमेट्री (छवि 2) द्वारा किया गया था।फिर MS/MS स्पेक्ट्रा का प्रोटीन अनुक्रम से मिलान किया जाता है और MaxQuant26,27 के साथ मात्रा निर्धारित की जाती है।सिम-एक्सएल प्रोग्राम का उपयोग करके प्राप्त स्पेक्ट्रा से क्रॉस-लिंक्ड पेप्टाइड्स की पहचान की गई थी, और व्यक्तिगत यौगिकों को xQuest28 और SIM-XL29 ओपन सोर्स कंप्यूटिंग सॉफ्टवेयर पाइपलाइनों (छवि 2) का उपयोग करके एक जटिल नेटवर्क में जोड़ा गया था।सिम-एक्सएल सरल या जटिल प्रोटीन मिश्रण में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन, आंतरिक श्रृंखलाओं और व्यक्तिगत श्रृंखलाओं की पहचान करता है और प्रोटीन संरचनाओं में इंटरैक्शन को देखने के लिए स्क्रिप्ट प्रदान करता है।इसके अलावा, यह MS/MS29 स्पेक्ट्रम गुणवत्ता के अनुसार प्रत्येक क्रॉस-रेफरेंस को आईडी स्कोर के रूप में रैंक करता है।कई अत्यधिक विश्वसनीय प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन और कॉम्प्लेक्स की पहचान की गई है, और आणविक गतिशीलता (एमडी) मॉडलिंग (छवि 2) 30, 31 का उपयोग करके कॉम्प्लेक्स के सह-इम्युनोप्रेग्रेशन और गठनात्मक परिवर्तनों का उपयोग करके इंटरैक्शन के एक नए सेट की जांच की गई है।
सीएलएमएस पद्धति का योजनाबद्ध अवलोकन।फ्लो-1 कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए 10 एनजी/एमएल आईएफएनα के साथ उपचारित किया गया, इसके बाद डीएसएस का उपयोग करके सीटू प्रोटीन क्रॉस-लिंकिंग की गई और इसके बाद सेल लिसीस और ट्रिप्सिनाइजेशन किया गया।क्रॉस-लिंक्ड नमूनों का विश्लेषण ऑर्बिट्रैप मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करके किया गया और एलसी-एमएस/एमएस के दौरान पेप्टाइड अग्रदूतों के विखंडन के लिए आगे नमूना लिया गया।क्रॉसलिंक्ड पेप्टाइड्स (सिम-एक्सएल) प्रोग्राम की स्पेक्ट्रम रिकग्निशन मशीन का उपयोग करके प्राप्त स्पेक्ट्रा से दो लिंक किए गए पेप्टाइड्स की पहचान की गई थी, और सभी यौगिकों को कम्प्यूटेशनल पाइपलाइनों का उपयोग करके एक जटिल नेटवर्क में जोड़ा गया था।झूठी सकारात्मक दर (एफडीआर) स्कोर के आधार पर कम आत्मविश्वास वाली बातचीत को फ़िल्टर करें।सह-इम्युनोप्रेजर्वेशन का उपयोग करके कई नए उच्च-निष्ठा प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की पुष्टि की गई, और आणविक गतिशीलता (एमडी) मॉडलिंग का उपयोग करके परिसरों में गठन संबंधी परिवर्तनों की जांच की गई।
अनस्टिम्युलेटेड और उत्तेजित IFNα नमूनों में मैक्सक्वांट का उपयोग करके क्रमशः ~ 30,500 और ~ 28,500 पेप्टाइड्स का पता लगाया गया (पूरक तालिका S1, चित्र 3 ए)।दोनों मामलों में पेप्टाइड लंबाई वितरण में बड़े पेप्टाइड्स का उच्च अनुपात दिखाया गया, जो क्रॉस-लिंक्ड पेप्टाइड्स की उपस्थिति का संकेत देता है (चित्र 3बी,सी)।इसके अलावा, IFNα-उपचारित नमूनों में 40-55 रेंज में बड़े पेप्टाइड्स का एक बड़ा अनुपात मौजूद था (चित्र 3C)।लॉग2 तीव्रता के विरुद्ध प्रोटीन मैपिंग से पता चला कि एमएक्स1, आईएफआईटी1/3, ओएएस2/3, डीडीएक्स58 और एचएलए-एफ (चित्रा 3डी) सहित अनुपचारित नमूनों की तुलना में क्लासिक इंटरफेरॉन-उत्तेजित प्रोटीन सबसे प्रचुर मात्रा में थे।रिएक्टोम पाथवे डेटाबेस का उपयोग करके IFNα उपचार के जवाब में तीन गुना से अधिक समृद्ध प्रोटीन के लिए मार्गों के विश्लेषण से पता चला कि एमएचसी-आई-मध्यस्थता एंटीजन प्रस्तुति और प्रसंस्करण सबसे प्रमुख मार्ग था (चित्रा 3ई)।पहले की रिपोर्टों के अनुरूप, OAS और ISG15 के साथ-साथ IFNα/β और साइटोकिन सिग्नलिंग द्वारा मध्यस्थता वाली एंटीवायरल प्रतिक्रियाएं सक्रिय मार्गों में से थीं।इसके अलावा, सिम-एक्सएल का उपयोग करके मूल रूप से प्राप्त एमएस/एमएस स्पेक्ट्रा से लाइसिन- और सेरीन-विशिष्ट प्रोटीन क्रॉस-लिंक की पहचान की गई थी।हाल के एक अध्ययन में 5 कोशिका प्रकारों में व्यक्तिगत आईएसजी ओवरएक्प्रेशन अध्ययन के मेटा-विश्लेषण द्वारा 9 वायरस वर्गों से 20 वायरस में फैले 104 आईएसजी की सूचना दी गई।हालाँकि, बड़े डेटासेट की स्क्रीनिंग की कम्प्यूटेशनल सीमाओं को दूर करने के लिए, हमने पडारिया एट अल द्वारा रिपोर्ट की गई आईआरडीएस जीन की सूची के बीच संभावित इंटरैक्शन का पता लगाने के लिए एक छोटे डेटासेट के साथ शुरुआत की, जिनमें से अधिकांश आईएसजी हैं।
IFNα (मैक्सक्वांट से प्राप्त डेटा) के जवाब में विभेदित रूप से व्यक्त क्रॉस-लिंक्ड प्रोटीन की पहचान।(ए) वेन आरेख IFNα14 उपचारित और अनुपचारित फ़्लो-1 नमूनों में पहचाने गए सामान्य और विशिष्ट पेप्टाइड्स की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है।अनुपचारित (बी) और आईएफएनα उपचारित (सी) क्रॉसलिंक्ड नमूनों की पेप्टाइड लंबाई वितरण।(डी) अनुपचारित और IFNα14 उपचारित फ़्लो-1 कोशिकाओं के बीच लॉग2 (एलएफक्यू तीव्रता) का प्रतिनिधित्व करने वाला हीट मैप।बायां पैनल IFNα की उपस्थिति में सबसे अधिक सक्रिय रूप से सक्रिय प्रोटीन दिखाता है।(ई) हिस्टोग्राम IFNα उपचार के बाद 20 प्रमुख संवर्धन मार्गों का प्रतिनिधित्व करता है।रिएक्टोम पाथवे डेटाबेस ने अपग्रेडित IFNα-उत्तरदायी प्रोटीन में चार गुना से अधिक परिवर्तनों का विश्लेषण किया।
इंटरफेरॉन-मध्यस्थता आईएसजी उत्तेजना अच्छी तरह से प्रलेखित है, लेकिन आणविक स्तर पर यह खराब रूप से समझा जाता है कि ये प्रोटीन जैविक कार्यों की एक विस्तृत श्रृंखला में कैसे परिणत होते हैं।हमने ज्ञात आईएसजी के बीच उच्च स्तर के विश्वास के साथ प्रोटीन इंटरैक्शन की जांच की।दिलचस्प बात यह है कि हमने एमएक्स1, यूएसपी18, आरओबीओ1, ओएएस3 और एसटीएटी1 प्रोटीन सहित एक नेटवर्क की पहचान की है जो आईएफएनα उपचार (चित्र 4, तालिका एस2) 32,33,34 के जवाब में एक बड़ा कॉम्प्लेक्स बनाते हैं।सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि ये इंटरैक्शन IFNα से उपचारित सभी ट्रिप्लिकेट्स में पाए गए और अनुपचारित नमूनों में नहीं पाए गए, जिससे पता चलता है कि वे विशेष रूप से IFNα उपचार के जवाब में बने थे।यह ज्ञात है कि STAT1 ट्रांसक्रिप्शनल रूप से इन ISG की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है, लेकिन प्रोटीन स्तर पर ISG के साथ इसकी बातचीत का अध्ययन नहीं किया गया है।STAT1 की क्रिस्टल संरचना से पता चला कि इसका हेलिकल डोमेन (सीसीडी) डिमर्स35 के निर्माण के दौरान डीएनए या प्रोटोमर्स के साथ बातचीत में शामिल नहीं है।ये α-हेलिकॉप्टर एक हेलिकल हेलिक्स संरचना बनाते हैं जो 35 होने वाली इंटरैक्शन के लिए मुख्य रूप से हाइड्रोफिलिक सतह क्षेत्र प्रदान करता है।हमारे सीएलएमएस डेटा में, हमने देखा कि एसटीएटी1 के साथ अधिकांश इंटरैक्शन सीसीडी, लिंकर डोमेन या सी-टर्मिनल टेल (अवशेष 700-708) (चित्र 4ए) से पहले एसएच2 डोमेन में हुए।एक पिछले अध्ययन में बताया गया है कि यूएसपी18 एसटीएटी2 के सीसीडी और डीएनए-बाइंडिंग डोमेन (डीबीडी) से जुड़ता है और टाइप I इंटरफेरॉन सिग्नलिंग 24 के निषेध को मध्यस्थ करने के लिए टाइप I इंटरफेरॉन रिसेप्टर IFNAR2 की सबयूनिट में भर्ती किया जाता है।हमारे डेटा से यह भी पता चला है कि USP18 उत्प्रेरक डोमेन STAT1 DBD (चित्र 4A,D) के साथ इंटरैक्ट करता है, यह सुझाव देता है कि STAT1 और STAT2 दोनों USP18 को IFNAR2 की ओर आकर्षित करने में भूमिका निभा सकते हैं।
IFNα से उपचारित क्रॉस-लिंक्ड कोशिकाओं में प्रोटीन-प्रोटीन ISG नेटवर्क की पहचान की गई।(ए) 2डी इंटरेक्शन प्लॉट प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन (सिम-एक्सएल प्रोग्राम में उत्पन्न) दिखाता है, जिसमें अंतर-आणविक इंटरैक्शन (क्रॉसलिंक कटऑफ 3.5 पर सेट) का प्रतिनिधित्व करने वाली रेखाएं होती हैं।विभिन्न पहचान वाले डोमेन को उनके रंग32 द्वारा चिह्नित किया जाता है: एमएक्स1 डोमेन, डायनामिन_एन (73-249), डायनामिन_एम (259-547), और जीईडी (569-660)।OAS3 डोमेन: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872), और OAS1_C (903-108)।डोमेन ROBO1, Ig_3 (67-151), I-सेट (170-258), I-सेट (262-347), Ig_3 (350-432), Ig_3 (454-529), fn3 (562-646), fn3 (678-758) और एफएन3 (777-864)।STAT1 फ़ील्ड: STAT_int (2-120), STAT_alpha (143-309), STAT_bind (321-458), SH2 (573-657), और STAT1_TAZ2bind (715-739)।(बी) क्रमशः नीले और लाल रंग में लेबल किए गए इंटरैक्शन और इंटरैक्शन के साथ क्रॉस-लिंक्ड प्रोटीन (एमएक्स1, यूबीपी18, ओएएस3, आरओबीओ1, और एसटीएटी1) का गोलाकार दर्शक।क्रॉस-लिंक सीमा 3.5 पर निर्धारित की गई थी।डॉट प्लॉट एमएक्स1 (सी), यूएसपी18 (डी), आरओबीओ1 (ई), और ओएएस3 (एफ) के साथ एसटीएटी1 इंटरेक्शन साइटों के साथ-साथ दो पेप्टाइड्स के बीच के या एस इंटरेक्शन साइटों को दर्शाते हैं।चित्र में, क्रॉस-लिंक स्कोर सीमा 3.0 पर सेट है।(जी) STAT1 और OAS3 DI डोमेन के बीच विभिन्न इंटरैक्शन साइटें PyMol (PyMOL आणविक ग्राफिक्स सिस्टम, संस्करण 2.0 श्रोडिंगर, LLC.) में उनकी प्रोटीन संरचनाओं पर आरोपित हैं;STAT1 (पीडीबी आईडी: 1बीएफ533) और ओएएस3 (पीडीबी आईडी: 4s3n34)।) कार्यक्रम.
मनुष्यों में यूएसपी18 के दो आइसोफॉर्म का वर्णन किया गया है, एक पूर्ण लंबाई वाला प्रोटीन जो मुख्य रूप से नाभिक में स्थित होता है, और एन-टर्मिनल डोमेन के बिना एक आइसोफॉर्म, यूएसपी18-एसएफ, जो साइटोप्लाज्म और नाभिक 36 में समान रूप से वितरित होता है।इसके अलावा, एन-टर्मिनस के असंरचित होने की भविष्यवाणी की गई थी और इसमें आइसोपेप्टिडेज़ गतिविधि या आईएसजी1537 बाइंडिंग की आवश्यकता नहीं है।हमारे अध्ययन में पहचाने गए अधिकांश इंटरैक्शन प्रोटीन के एन-टर्मिनस पर स्थित थे, जिससे पता चलता है कि इन इंटरैक्शन में पूर्ण-लंबाई यूएसपी18 (चित्रा 4ए,डी) शामिल है और इस प्रकार नाभिक में होने की संभावना है।इसके अलावा, हमारा डेटा यह भी दर्शाता है कि एन-टर्मिनस प्रोटीन-टू-प्रोटीन इंटरैक्शन के लिए विशिष्ट है।IFNAR2 बाइंडिंग साइट अवशेष 312-368 के बीच स्थित है, और विशेष रूप से, कॉम्प्लेक्स में कोई भी प्रोटीन इस क्षेत्र से नहीं जुड़ता है (चित्र 4ए) 37,38।एक साथ लिए गए इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि IFNAR2 बाइंडिंग डोमेन का उपयोग विशेष रूप से रिसेप्टर प्रोटीन द्वारा किया जाता है।इसके अलावा, केवल OAS3 और ROBO1 को एन-टर्मिनस और IFNAR2 बाइंडिंग साइट (चित्र 4A) के अपस्ट्रीम डोमेन से संबद्ध पाया गया।
ROBO1 ट्रांसमेम्ब्रेन सिग्नलिंग अणुओं के इम्युनोग्लोबुलिन (Ig) सुपरफैमिली से संबंधित है और इसमें बाह्य क्षेत्र में पांच Ig डोमेन और तीन फ़ाइब्रोनेक्टिन (Fn) डोमेन शामिल हैं।इन बाह्य कोशिकीय डोमेन के बाद एक झिल्ली-समीपस्थ क्षेत्र और एक एकल ट्रांसमेम्ब्रेन हेलिक्स 39 होता है। एक असंरचित इंट्रासेल्युलर क्षेत्र सी-टर्मिनस पर स्थित होता है और इसमें संरक्षित अनुक्रम रूपांकनों होते हैं जो प्रभावकारी प्रोटीन बंधन39 में मध्यस्थता करते हैं।अमीनो एसिड ~1100 से 1600 तक फैला हुआ क्षेत्र अधिकतर अव्यवस्थित है।हमने पाया कि एमएक्स1 आईजी, एफएन और इंट्रासेल्युलर डोमेन के माध्यम से आरओबीओ1 के साथ इंटरैक्ट करता है, जबकि एसटीएटी1 के साथ अधिकांश इंटरैक्शन इसके सीसीडी, लिंकर डोमेन और आरओबीओ1 के सी-टर्मिनस के बीच होता है (चित्र 4ए,ई)।दूसरी ओर, DI, DIII और OAS3 लिंकर क्षेत्रों के साथ इंटरैक्शन पूरे ROBO1 प्रोटीन में वितरित किए गए (चित्र 4A)।
ऑलिगोएडेनाइलेट सिंथेज़ (ओएएस) प्रोटीन परिवार इंट्रासेल्युलर डबल-स्ट्रैंडेड आरएनए (डीएसआरएनए) को स्वीकार करता है और बांधता है, गठनात्मक परिवर्तनों से गुजरता है, और 2′,5′-लिंक्ड ऑलिगोएडेनाइलेट्स (2-5 एएस) 40 को संश्लेषित करता है।यह पाया गया कि तीन OASs में से, OAS3 dsRNA के लिए सबसे अधिक समानता प्रदर्शित करता है और 2-5 As की सबसे कम मात्रा को संश्लेषित करता है, जो RNase L को सक्रिय कर सकता है और इस तरह वायरल प्रतिकृति 41 को सीमित कर सकता है।OAS परिवार में पोलीमरेज़ बीटा (पोल-बीटा) जैसे न्यूक्लियोटाइड ट्रांसफ़ेज़ डोमेन होते हैं।पिछले शोध से पता चला है कि सी-टर्मिनल डोमेन (DIII) की उत्प्रेरक गतिविधि dsRNA-बाइंडिंग डोमेन (DI) पर निर्भर है, जो OAS342 के सक्रियण के लिए आवश्यक है।हमने देखा कि OAS3 के DI और DII डोमेन CCD और SH2 और STAT1 TAD के बीच एक छोटे जंक्शन क्षेत्र के साथ इंटरैक्ट करते हैं (चित्र 4A,F)।प्रोटीन संरचना पर विभिन्न क्रॉसलिंकिंग साइटों को ओवरले करने से β-शीट और DBD STAT1 लूप और OAS3 (छवि 4G) के DI डोमेन में अवशेषों 60-75 द्वारा गठित एक खुली जेब या गुहा के बीच बातचीत का पता चला।कॉम्प्लेक्स में प्रोटीन के अभिविन्यास ने यह भी संकेत दिया कि OAS3 के साथ किसी भी इंटरैक्शन ने इसके DI डोमेन (छवि S1A) की डीएनए-बाइंडिंग क्षमता में हस्तक्षेप नहीं किया।इसके अलावा, GTPase MX1 का एन-टर्मिनल डोमेन OAS3 के DI और DIII डोमेन के साथ बड़े पैमाने पर इंटरैक्ट करता है (चित्र 4A)।हमने सभी तीन IFNα-उपचारित दोहरावों में OAS1 और MX1 के बीच एक इंटरैक्शन भी देखा, जहां एक एकल OAS1 डोमेन (उत्प्रेरक रूप से सक्रिय) ने सभी तीन MX1 डोमेन (चित्र S2A,B) के साथ इंटरैक्ट किया।
एमएक्स प्रोटीन डायनेइन-जैसे GTPases के एक बड़े परिवार का हिस्सा हैं जिसमें एक N-टर्मिनल GTPase डोमेन होता है जो GTP को बांधता है और हाइड्रोलाइज़ करता है, एक मध्यवर्ती डोमेन जो स्व-असेंबली में मध्यस्थता करता है, और एक C-टर्मिनल ल्यूसीन ज़िपर जो GTPase (LZ) के रूप में कार्य करता है ).डोमेन प्रभावकार डोमेन25,43.एमएक्स1 वायरल जीन43 के प्रतिलेखन को अवरुद्ध करने के लिए वायरल पोलीमरेज़ की उप-इकाइयों से जुड़ता है।पहले रिपोर्ट की गई यीस्ट टू-हाइब्रिड स्क्रीन से पता चला है कि PIAS1-संबद्ध MX1 डीएनए-बाध्यकारी गतिविधि को अवरुद्ध करके STAT1-मध्यस्थता जीन सक्रियण को रोकता है और इसमें SUMO E344,45 लिगेज गतिविधि भी होती है।यहां, हम प्रदर्शित करते हैं कि एमएक्स1 एसटीएटी1 (चित्रा 4सी,डी) से जुड़ता है, हालांकि यह इंटरैक्शन आईएफएनα के जवाब में एसटीएटी1-मध्यस्थता जीन सक्रियण को कैसे प्रभावित करता है, इसके लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है।इसके अलावा, हमने यह भी पाया कि MX1 ने तीनों IFNα-उपचारित दोहराव (छवि S2C) में IFIT3 और DDX60 के साथ बातचीत की।
DDX60 एक IFN-प्रेरित साइटोप्लाज्मिक हेलिकेज़ है जिसे पहले वायरल RNA46 के RIG-I-स्वतंत्र क्षरण में भूमिका निभाने की सूचना मिली है।यह RIG-I के साथ इंटरैक्ट करता है और लिगैंड-विशिष्ट तरीके से इसके सिग्नलिंग को सक्रिय करता है 46. DDX60 में एक DEXD/H-बॉक्स हेलिकेज़ डोमेन और एक C-टर्मिनल हेलिकेज़ डोमेन होता है जो वायरल RNA और DNA47 को बांधता है।एमएक्स1 और आईएफआईटी3 के साथ इसकी अधिकांश बातचीत लंबे एन- और सी-टर्मिनल क्षेत्रों में बिना विहित डोमेन या रूपांकनों के होती है (चित्र एस2ई,एफ)।हालाँकि, MX1 DEXD/H-बॉक्स हेलिकेज़ डोमेन (चित्र S2E) से भी जुड़ा है।आईएफआईटी परिवार के प्रोटीन में एक विशिष्ट हेलिक्स-टर्न-हेलिक्स मोटिफ की अग्रानुक्रम प्रतियां होती हैं जिन्हें टेट्रापेप्टाइड रिपीट (टीपीआर) कहा जाता है।IFIT3 को RIG-I सिग्नलिंग का एक सकारात्मक मॉड्यूलेटर पाया गया और इसलिए यह MAVS कॉम्प्लेक्स का एक घटक है।कुल मिलाकर, हमारा डेटा बताता है कि IFIT3 और DDX60 मुख्य रूप से IFIT3 के TPR 3–6 के बीच के क्षेत्र में इंटरैक्ट करते हैं और RIG-I/MAVS सिग्नलिंग (चित्र S2F) में भूमिका निभा सकते हैं।
यह देखते हुए कि संपूर्ण प्रोटिओम की स्क्रीनिंग कम्प्यूटेशनल रूप से गहन है, फिर हमने IFNα-उपचारित दोहरावों में से एक की उपस्थिति के लिए संपूर्ण मानव यूनीप्रोट डेटाबेस की जांच की।इस प्रतिकृति में, हमें एचएलए-ए के लिए कई अत्यधिक विश्वसनीय इंटरैक्शन नेटवर्क मिले।एमएस/एमएस स्पेक्ट्रा द्वारा पहचाने गए प्रोटीन मार्गों के विश्लेषण से पता चला कि एमएचसी-आई-आधारित एंटीजन प्रसंस्करण और प्रस्तुति इंटरफेरॉन (छवि 3 डी) से प्रेरित मुख्य मार्ग है।इसलिए, हमने सभी क्रॉस-लिंक्ड नमूनों में उच्च स्तर के आत्मविश्वास के साथ एमएचसी-आई अणुओं के प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने पर ध्यान केंद्रित किया।HLA में α1, α2 और α3 डोमेन और प्रकाश श्रृंखलाएं होती हैं, और माइक्रोग्लोबुलिन β2 (β2m) एक स्थिर चैपरोन प्रोटीन49 है।एक बार एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम में इकट्ठा होने के बाद, एचएलए पेप्टाइड लिगेंड्स50 की अनुपस्थिति में अस्थिर होता है।पेप्टाइड-बाइंडिंग ग्रूव गैर-पेप्टाइड रूप में अत्यधिक बहुरूपी और असंरचित α1 और α2 डोमेन और अपेक्षाकृत कम बहुरूपी α351 डोमेन द्वारा बनता है।IFNα की उपस्थिति में, हमने दो HLA-A कॉम्प्लेक्स का पता लगाया: एक HMGA1 और H2B (चित्र 5, तालिका S3) के साथ इंटरैक्ट करता है और दूसरा MDN1, LRCH4 और H2B (चित्र 6) के साथ इंटरैक्ट करता है।
IFNα H2B (H2BFS) और HMGA1 के साथ HLA-A इंटरेक्शन नेटवर्क को प्रेरित करता है।(ए) 2डी प्लॉट (सिम-एक्सएल सॉफ्टवेयर में उत्पन्न) एच2बी-एचएलए-ए-एचएमजीए1 कॉम्प्लेक्स में विभिन्न प्रकार के इंटरैक्शन को दर्शाता है: इंटरलिंक (नीला), इंटरलिंक (लाल) और सिंगल लिंक (काला)।.विभिन्न पहचान वाले डोमेन रंग कोडित32 हैं: H2B (हिस्टोन; 2–102) और MHC-I (MHC_1; 25–203, समूह C1; 210–290 और MHC_I_C; 337–364)।क्रॉस-लिंक सीमा 3.5 पर निर्धारित की गई थी।डॉट प्लॉट एच2बी (बी) और एचएमजीए1 (सी) के साथ एचएलए-ए इंटरेक्शन साइटों के साथ-साथ दो पेप्टाइड्स के बीच के या एस इंटरेक्शन साइटों को दर्शाते हैं।चित्र में, क्रॉस-लिंक स्कोर सीमा 3.0 पर सेट है।(डी) PyMOL कार्यक्रम में H2B, HLA-A और HMGA1 प्रोटीन की संरचनाओं में दिखाए गए प्रोटीन के बीच संबंध।इन संरचनाओं को Phyre2 सर्वर (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) का उपयोग करके तैयार किया गया था और H2B, HLA-A और HMGA1 प्रोटीन के लिए टेम्पलेट संरचनाएं क्रमशः 1kx552, 1kj349 और 2eze55 थीं।
IFNα H2B (H2BFS), MDN1 और LRCH4 के साथ HLA-A इंटरेक्शन नेटवर्क को प्रेरित करता है।(ए) इंट्रामोलेक्यूलर (लाल) और इंटरमोलेक्यूलर (नीला) क्रॉसलिंक को 2डी इंटरैक्टिव मानचित्र (सिम-एक्सएल सॉफ्टवेयर में जेनरेट किया गया) पर प्रस्तुत किया गया है, जिसमें एमडीएन1 को एक सर्कल के रूप में दर्शाया गया है।क्रॉस-लिंक सीमा 3.5 पर निर्धारित की गई थी।विभिन्न पहचान वाले डोमेन रंग कोडित32 हैं: H2B (हिस्टोन; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, समूह C1; 210–290 और MHC_I_C; 337–364) और LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137-194) और सीएच (535-641))।(बी) PyMOL कार्यक्रम में H2B, HLA-A, LRCH4, और MDN1 प्रोटीन की संरचनाओं में दिखाए गए प्रोटीन के बीच संबंध।इन संरचनाओं को H2B, HLA-A, LRCH4 और MDN1 प्रोटीन के लिए टेम्पलेट संरचनाओं 1kx552, 1kj349, 6hlu62 और 6i2665 के साथ Phyre2 सर्वर (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) का उपयोग करके तैयार किया गया था। क्रमश।H2B (C), LRCH4 (D), और MDN1 (E) के साथ HLA-A के लिए K या S इंटरैक्शन साइट दिखाने वाले डॉट प्लॉट।प्लॉट के लिए, क्रॉस-लिंक स्कोर सीमा 3.0 पर सेट की गई थी।
जीनोम की अखंडता को बनाए रखने के अलावा, हिस्टोन एच2बी प्रतिलेखन के नियमन में भी शामिल है।H2B प्रोटीन में एक केंद्रीय हिस्टोन डोमेन (HFD) होता है जो लूप द्वारा अलग किए गए तीन α-हेलिकॉप्टर और एक C-टर्मिनल टेल 41,52 द्वारा बनता है।H2B के साथ अधिकांश इंटरैक्शन α1 हेलिक्स में होता है, जो HFD हेटेरोडिमर (छवि 5 ए, बी) के साथ ट्रिमराइजेशन प्रदान करता है।हालाँकि लाइसिन डीएनए बाइंडिंग में शामिल होते हैं, कुछ लाइसिन वैकल्पिक एसिटिलेशन या मिथाइलेशन साइट भी होते हैं।उदाहरण के लिए, H2B के अवशेष K43, K46 और K57 सीधे डीएनए बाइंडिंग में शामिल नहीं हैं, लेकिन विभिन्न पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल संशोधनों53 के लक्ष्य हैं।इसी तरह, H2B में अवशेष K44, K47 और K57 IFNα की उपस्थिति में एक वैकल्पिक भूमिका निभा सकते हैं, जिसमें अन्य प्रोटीन के साथ बातचीत भी शामिल है (चित्र 5A, B)।इसके अलावा, एक्स्ट्राक्रोमोसोमल हिस्टोन एच2बी विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को सक्रिय करता है, संक्रामक एजेंटों या क्षतिग्रस्त कोशिकाओं54 से प्राप्त डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए (डीएसडीएनए) टुकड़ों का पता लगाने के लिए साइटोसोलिक सेंसर के रूप में कार्य करता है।डीएनए वायरस की उपस्थिति में, H2B कमी ने IFN-β उत्पादन और STAT154 फॉस्फोराइलेशन को रोक दिया।H2B को अन्य कोर हिस्टोन्स54 की तुलना में नाभिक के अंदर और बाहर तेज़ी से जाने के लिए भी जाना जाता है।चयनित अनुपचारित नमूनों में एमडीएन1 और एलआरसीएच4 के साथ एच2बी इंटरैक्शन भी देखा गया।हमने पाया कि HLA-A ने सभी तीन IFNα-उपचारित नमूनों में और एक अनुपचारित दोहराए गए नमूने में H2B के साथ परस्पर क्रिया की।ये डेटा ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन से स्वतंत्र एक वैकल्पिक शारीरिक कार्य में H2B की भूमिका को दर्शाते हैं।
एचएमजीए1 (उच्च गतिशीलता समूह एटी-हुक 1), रोग को बढ़ावा देने वाले अमीनो एसिड से भरपूर एक छोटा न्यूक्लियोप्रोटीन, एचएलए-ए के सहयोग से पहचाना गया है।इसमें एक अम्लीय सी-टर्मिनल पूंछ और तीन अलग-अलग डीबीडी हैं जिन्हें एटी हुक कहा जाता है क्योंकि वे डीएसडीएनए55,56 में एटी-समृद्ध क्षेत्र के छोटे खांचे से जुड़ते हैं।यह बंधन डीएनए को मोड़ने या सीधा करने का कारण बनता है, जिससे विहित प्रतिलेखन कारकों को इसके सर्वसम्मति अनुक्रम तक पहुंचने की अनुमति मिलती है।माना जाता है कि सी-टर्मिनल पूंछ प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन और ट्रांसक्रिप्शन कारकों की भर्ती में शामिल है, क्योंकि सी-टर्मिनल विलोपन म्यूटेंट ट्रांसक्रिप्शन शुरू करने में असमर्थ हैं।इसके अलावा, इस डोमेन में कई संरक्षित फॉस्फोराइलेशन साइटें हैं जो किनेसेस 58 के लिए ज्ञात सब्सट्रेट हैं।हमने सी-टर्मिनल डोमेन के बाहर एचएमजीए1 के साथ एचएलए-ए और एच2बी इंटरैक्शन का अवलोकन किया, जिससे पता चलता है कि सी-टर्मिनल डोमेन का उपयोग मुख्य रूप से ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर बाइंडिंग (चित्र 5ए, सी) के लिए किया जाता है।एचएमजीए प्रोटीन एडॉप्टर डीएनए से जुड़ने के लिए हिस्टोन एच1 के साथ प्रतिस्पर्धा करते हैं, जिससे पहुंच बढ़ जाती है57।इसी तरह, ऐसा लगता है कि एचएमजीए हिस्टोन एच1 के साथ प्रतिस्पर्धा में लिंकर डीएनए के साथ हिस्टोन एच2बी के साथ इंटरैक्ट करता है।HMGB1 डेंड्राइटिक कोशिकाओं में HLA-A, -B, और -C की अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है, जिससे उनकी सक्रियता59 हो जाती है, लेकिन HMG और HLA के बीच बातचीत पहले रिपोर्ट नहीं की गई है।हमने पाया कि HMGA1 HLA-A के α1 और α3 डोमेन के साथ इंटरैक्ट करता है, अधिकांश इंटरैक्शन इसके 3 DBD के बाहर होता है (चित्र 5A,C)।हमारे हाथ में, HLA-A को नाभिक में स्थानीयकृत पाया गया (डेटा नहीं दिखाया गया है), और यह देखते हुए कि H2B और HMGA1 भी नाभिक में मौजूद हैं, यह अंतःक्रिया संभवतः नाभिक में होती है।H2B, HLA-A और HMGA1 के बीच मापे गए विशिष्ट जोड़ चित्र 5D में दिखाए गए हैं।
अन्य प्रोटीनों के साथ एचएलए-ए की अधिकांश अंतःक्रियाएं इसके α1 और α2 डोमेन और अव्यवस्थित सी-टर्मिनल डोमेन (चित्र 6) के भीतर होती हैं।इनमें से एक उदाहरण में, हमने पाया कि एचएलए-ए एलआरसीएच4 के अव्यवस्थित एन-टर्मिनल टेल के साथ इंटरैक्ट करता है (चित्र 6ए,डी)।एलआरसीएच4 टीएलआर4 सक्रियण और एलपीएस साइटोकिन प्रेरण को नियंत्रित करता है, जिससे जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया60,61 नियंत्रित होती है।यह एक झिल्ली प्रोटीन है जिसमें नौ ल्यूसीन-रिच रिपीट (एलआरआर) और इसके एक्टोडोमैन में एक कैल्मोडुलिन (सीएच) होमोलॉजी मोटिफ होता है, इसके बाद एक ट्रांसमेम्ब्रेन डोमेन (टीएमडी) 60, 62 होता है।सीएच डोमेन को प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन 60 में मध्यस्थ बताया गया है।एलआरआर और सीएच डोमेन के बीच लगभग 300 अमीनो एसिड का विस्तार अपेक्षाकृत सुलभ लेकिन अव्यवस्थित है।प्रोटीन-प्रोटीन नेटवर्क और वेसिकुलर ट्रांसपोर्ट 63 के मध्यस्थों के रूप में अव्यवस्थित क्षेत्रों के कार्य के आधार पर, हमने पाया कि अधिकांश प्रोटीन इंटरैक्शन अव्यवस्थित क्षेत्रों में होते हैं।एमडीएन1 के साथ अंतःक्रियाएं एलआरआर1, एलआरआर6, सीएच डोमेन और यादृच्छिक क्षेत्रों सहित प्रोटीन की पूरी लंबाई में वितरित की गईं, जबकि एच2बी मुख्य रूप से सीएच डोमेन से जुड़ा हुआ है (चित्र 6ए, बी)।विशेष रूप से, किसी भी इंटरैक्शन में टीएमजे शामिल नहीं था, जो सीएलएमएस दृष्टिकोण की विशिष्टता का सुझाव देता है (चित्र 6ए, बी)।
MDN1 को HLA-A प्रोटीन नेटवर्क (चित्र 6A) के भाग के रूप में भी पहचाना गया है।यह प्रोटीन के AAA परिवार (विभिन्न गतिविधियों से जुड़े एटीपीसेज़) से संबंधित है।यह वही एन-टर्मिनल एएए डोमेन है जो हेक्सामेरिक रिंग में व्यवस्थित होता है और 60एस 64 राइबोसोमल सबयूनिट से असेंबली फैक्टर को हटा देता है।dynein64,65,66 के समान प्रतीत होता है।इसके अलावा, एएसपी/ग्लू समृद्ध क्षेत्र के बाद MIDAS डोमेन (धातु आयन निर्भर साइट) आता है।एमडीएन1 (लगभग 5600 अमीनो एसिड) के बड़े आकार और अच्छी तरह से अध्ययन किए गए प्रोटीन के साथ इसकी सीमित समरूपता के कारण, मनुष्यों में इसकी संरचना और कार्य के बारे में बहुत कम जानकारी है।हमने HLA-A, H2B, और LRCH4 को MDN1 बाइंडिंग पार्टनर के रूप में पहचाना और PyMol में प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के रूप में उनके अभिविन्यास का खुलासा किया (चित्र 6A,B)।ये तीन प्रोटीन एएए डोमेन, डायनेइन-लाइक लिंकर डोमेन और संभवतः MIDAS MDN1 डोमेन के साथ इंटरैक्ट करते हैं।पिछली रिपोर्ट में, चारा प्रोटीन की आत्मीयता शुद्धि ने एमडीएन1 को हिस्टोन एच2बी67 से जुड़े प्रोटीन के रूप में पहचाना।इसके अलावा, एक हालिया अध्ययन में एफ़िनिटी-प्यूरिफाइड मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके एचसीटी116 कोशिकाओं में एमडीएन और एचएलए-बी के बीच बातचीत की भी सूचना दी गई है, जो हमारे निष्कर्षों68 का समर्थन करती है।IFNα-उपचारित नमूनों में इस कॉम्प्लेक्स की पहचान इंटरफेरॉन सिग्नलिंग में MDN1 की भूमिका का सुझाव देती है।
क्योंकि एचएलए जीन अत्यधिक बहुरूपी होते हैं, इसलिए हमने फ़्लो-1 कोशिकाओं के आरएनए अनुक्रमण डेटा (डेटा नहीं दिखाया गया है) से एचएलए-ए, -बी, और -सी मैपिंग रीडिंग निकाली।अनुक्रमण रीडिंग के अनुरूप पेप्टाइड अनुक्रमों ने उन क्षेत्रों में एचएलए-ए, -बी, और -सी के बीच महत्वपूर्ण अंतर प्रकट किया जहां क्रॉस-लिंक्ड पेप्टाइड्स एचएलए-ए (चित्रा एस 3) में स्थित थे।इसके अलावा, हमने H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4 प्रोटीन के साथ HLA-B/C अणुओं की प्रोटीन-से-प्रोटीन क्रॉस-लिंकिंग नहीं देखी।इससे पता चलता है कि HLA-A, MDN1, LRCH1 और HMGA1 के बीच पाया जाने वाला प्रोटीन इंटरैक्शन HLA-A विशिष्ट है।इसके अलावा, गैर-क्रॉसलिंक्ड नमूनों (तालिका एस4) के प्रोटिओमिक विश्लेषण से पता चला कि एचएलए-ए में एचएलए-बी या एचएलए-सी की तुलना में उच्च अनुक्रम कवरेज है।HLA-A के लिए पहचाने गए पेप्टाइड्स IFNα-उपचारित और अनुपचारित दोनों नमूनों में तीव्रता में उच्च थे।
यह सुनिश्चित करने के लिए कि यहां पहचानी गई अंतःक्रियाएं निकट स्थानिक निकटता में दो प्रोटीनों के गैर-विशिष्ट क्रॉस-लिंकिंग के कारण नहीं थीं, हमने सह-इम्युनोप्रेजर्वेशन परख करके दो नए एचएलए-ए इंटरैक्टिंग कारकों की पुष्टि की।अंतर्जात एमडीएन1 और एच2बी के साथ एचएलए-ए इंटरैक्शन का पता IFNα-उपचारित और अनुपचारित फ़्लो-1 कोशिकाओं (चित्र 7, चित्र S4) दोनों में लगाया गया।हमने पुष्टि की कि एचएलए-ए को इम्यूनोप्रेसीपिटेट्स में एच2बी द्वारा कैप्चर किया गया था और यह संबंध IFNα उपचार के कारण था क्योंकि अनुपचारित कोशिकाओं से इम्यूनोप्रेसीपिटेट नमूनों में एचएलए-ए अनुपस्थित था (चित्र 7ए)।हालाँकि, हमारा डेटा सुझाव देता है कि IFNα H2B और MDN1 के लिए HLA-A बाइंडिंग को अलग-अलग नियंत्रित करता है।IFNα H2B और HLA-A के बीच जुड़ाव को प्रेरित करता है, लेकिन MDN1 के साथ इसके जुड़ाव को कम करता है।हमने पाया कि MDN1 नियंत्रण में HLA-A के साथ जुड़ा हुआ था, और IFNα के जुड़ने से IFNα द्वारा MDN1 प्रेरण से स्वतंत्र इस इंटरैक्शन को कम कर दिया गया (चित्र 7B,C)।इसके अलावा, HLA-A इम्युनोप्रेवेरेशन ने A549 कोशिकाओं (छवि S4) में H2B को कैप्चर किया, जिससे पता चलता है कि यह इंटरैक्शन सेल प्रकार से स्वतंत्र है।कुल मिलाकर, ये परिणाम एच2बी और एमडीएन1 के साथ एचएलए-ए की इंटरफेरॉन-मध्यस्थता वाली बातचीत का समर्थन करते हैं।
HLA-A H2B और MDN1 को सह-शुद्ध करता है।प्रतिनिधि अंतर्जात एच2बी (ए) और एमडीएन1 (बी) इम्युनोब्लॉट्स को आईएफएनα-उपचारित फ़्लो-1 कोशिकाओं से प्रतिरक्षित किया गया और संकेतित एंटीबॉडी के लिए जांच की गई।माउस और खरगोश आईजीजी का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था।(सी) विभिन्न एंटीजन की सापेक्ष मात्रा (इनपुट) को संकेतित एंटीबॉडी के खिलाफ जांचे गए इम्युनोब्लॉट्स द्वारा दर्शाया गया है, β-एक्टिन का उपयोग लोडिंग नियंत्रण के रूप में किया गया था।
इंटरफेरॉन-प्रेरित अत्यधिक विश्वसनीय क्रॉस-लिंक्ड नेटवर्क, H2B-HLA-A-HMGA1 में से एक के संरचनात्मक गुणों की जांच की गई।हमने इस परिसर में शामिल प्रोटीन की गठनात्मक गतिशीलता को समझने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में आणविक गतिशीलता मॉडलिंग का उपयोग किया (चित्रा 8)।सीएलएमएस डेटा के निष्कर्ष एच2बी, एचएलए-ए और एचएमजीए1 प्रोटीन की विभिन्न संरचना की संभावना का सुझाव देते हैं।इसलिए, निम्नलिखित संभावित परिसरों को एक विलायक माध्यम में तैयार किया गया था: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A, और H2B-HLA-A-HMGA1।एमओई (आणविक ऑपरेटिंग पर्यावरण; केमिकल कंप्यूटिंग ग्रुप इंक., मॉन्ट्रियल, क्यूबेक, कनाडा) पैकेज का उपयोग करते हुए एक प्रारंभिक प्रोटीन-प्रोटीन डॉकिंग स्क्रीन ने संभावित अनुरूपताओं का सुझाव दिया जो इन प्रोटीनों के बीच भिन्न हैं (चित्र 8ए)।डॉकिंग प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के विज़ुअलाइज़ेशन से कई इंटरैक्शन और संभावित अनुरूपताएं सामने आईं (चित्र 5ए, 8)।इस प्रकार, एक संभावित अनुरूपण चित्र 8ए (लेबल क्रॉस-लिंक के साथ) में दिखाया गया है और एमडी मॉडलिंग पाइपलाइन का उपयोग करके इसका आगे मूल्यांकन किया गया था।इसके अलावा, H2B या HMGA1 को HLA-A से जोड़ना HLA-A के लिए H2B की उच्च आत्मीयता को उजागर करता है (चित्र 8A)।
H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A, और H2B-HLA-A-HMGA1 कॉम्प्लेक्स के बीच संभावित नेटवर्क की गठनात्मक गतिशीलता।(ए) बायां पैनल इंट्रामोल्युलर (लाल) और इंटरमॉलिक्युलर (नीला) क्रॉसलिंक (क्रॉसलिंक कटऑफ 3.5 पर सेट) का एक 2डी मैप (सिम-एक्सएल सॉफ्टवेयर में जेनरेट किया गया) है।इसके अलावा, पहचाने गए क्रॉस-लिंकिंग अवशेषों को एच2बी, एचएलए-ए और एचएमजीए1 प्रोटीन की संरचनाओं पर लेबल किया जाता है।इन प्रोटीनों की संबद्ध संरचनाएं एमओई पैकेज में कार्यान्वित डॉकिंग पाइपलाइन का उपयोग करके निकाली गईं।निचला बायाँ पैनल विभिन्न प्रोटीन-प्रोटीन बाइंडिंग एफ़िनिटी (GBVI/WSA dG; kcal/mol) के साथ H2B-HLA-A और HMGA1-HLA-A कॉम्प्लेक्स के विभिन्न संभावित अनुरूपताओं को दर्शाता है।(बी) प्रत्येक प्रोटीन संरचना के लिए परमाणु स्थिति (हाइड्रोजन परमाणुओं को छोड़कर) का मानक विचलन (आरएमएसडी)।(सी) अवधि 10 एनएस की विशिष्ट बातचीत पर विचार करते हुए विभिन्न सिम्युलेटेड कॉम्प्लेक्स से इंटरमॉलिक्युलर प्रोटीन-प्रोटीन हाइड्रोजन बॉन्ड इंटरैक्शन।एच-बॉन्ड दाता-स्वीकर्ता कटऑफ दूरी 3.5 Å पर सेट की गई थी, और दाता-एच-स्वीकर्ता कटऑफ कोण ≥ 160°-180° पर सेट किया गया था।(डी) डमी एचएलए-ए-एच2बी और एचएलए-ए-एचएमजीए1 कॉम्प्लेक्स से निकाले गए, 20 एनएस तक फैले, अपने संबंधित भागीदारों के साथ एचएलए-ए प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन बनाने वाले लेबल वाले अवशेष।प्रोटीन संरचनाएं 100 एनएस एमडीएस की औसत संरचना का प्रतिनिधित्व करती हैं।(ई) दो पेप्टाइड्स के बीच के या एस इंटरैक्शन साइट के आधार पर 100 एनएस से अधिक एच2बी-एचएलए सिमुलेशन द्वारा ट्रैक किए गए इंटरैक्शन की तुलना में एचएलए-ए-एच2बी और एचएलए-ए-एचएमजीए1 कॉम्प्लेक्स के बीच इंटरैक्शन।कॉम्प्लेक्स /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1।क्रॉस-लिंक के मूल्यांकन के लिए सीमा मान 3.0 पर सेट किया गया था, और एमडीएस से ≥ 10 एनएस लेने वाले विशिष्ट इंटरैक्शन को ध्यान में रखा गया था।BIOVIA डिस्कवरी स्टूडियो (डसॉल्ट सिस्टम्स, BIOVIA कॉर्प, सैन डिएगो, सीए, यूएसए) और आणविक ऑपरेटिंग पर्यावरण (MOE; केमिकल कंप्यूटिंग ग्रुप इंक, मॉन्ट्रियल, क्यूबेक, कनाडा) पैकेज का उपयोग करके प्रोटीन संरचनाओं की कल्पना की गई थी।
समय के साथ एचएलए-ए अणुओं की स्थिरता (मानक विचलन; आरएमएसडी या मानक विचलन; आरएमएसएफ) ने संकेत दिया कि परिसरों में एच2बी या एचएमजीए1 प्रोटीन की उपस्थिति ने एचएलए-ए को स्थिर कर दिया (चित्र 8बी, चित्र एस5)।HMGA1 प्रोटीन HLA-A की B2M साइट से कसकर बंध जाता है, जिससे HLA-A-HMGA1 या H2B-HLA-A-HMGA1 कॉम्प्लेक्स में HLA-A अमीनो एसिड की स्थिरता उत्पन्न हो जाती है (चित्र 8B, चित्र S5)।विशेष रूप से, एचएलए अवशेष ~60-90 और ~180-210 एच2बी की उपस्थिति में कम लचीले पाए गए (चित्र 8बी)।H2B और HMGA1 ने H2B-HLA-A-HMGA1 कॉम्प्लेक्स में HLA-A के साथ अकेले H2B या HMGA1 के बंधन की तुलना में बेहतर बंधन दिखाया (चित्र 8C,D; तालिका S5)।हाइड्रोजन बॉन्डिंग में शामिल अवशेष (एमडी मॉडल उच्च अधिभोग ≥ 10 एनएस) कॉम्प्लेक्स में सीएलएमएस इंटरैक्शन साइटों (के या एस अवशेष) के साथ मेल खाते हैं, यह सुझाव देते हैं कि सीएलएमएस द्वारा पहचाने गए इंटरैक्शन बहुत विश्वसनीय हैं।विश्वसनीयता (चित्र 8ई)।सीएलएमएस और एमडी मॉडलिंग में, लगभग 190-210 और लगभग 200-220 अमीनो एसिड के बीच एचएलए-ए अवशेष क्रमशः एच2बी और एचएमजीए1 को बांधते हुए पाए गए (चित्र 8ई)।
प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन गतिशील संरचनात्मक नेटवर्क बनाते हैं जो कुछ उत्तेजनाओं के जवाब में इंट्रासेल्युलर संचार में मध्यस्थता करते हैं।क्योंकि कई प्रोटिओमिक्स दृष्टिकोण प्रोटीन के समग्र स्थिर अवस्था स्तर में परिवर्तन का पता लगाते हैं, प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन डायनेमिक्स को बाइंडिंग इंटरफेस को पकड़ने के लिए अतिरिक्त उपकरणों की आवश्यकता होती है, और सीएलएमएस एक ऐसा उपकरण है।इंटरफेरॉन सिग्नलिंग सिस्टम एक साइटोकिन नेटवर्क है जो कोशिकाओं को पर्यावरणीय रोगजनक और आंतरिक रोग संबंधी संकेतों की एक श्रृंखला पर प्रतिक्रिया करने की अनुमति देता है, जो इंटरफेरॉन-प्रेरक प्रोटीन के सबसेट के प्रेरण में परिणत होता है।हमने यह निर्धारित करने के लिए सीएलएमएस लागू किया कि क्या इंटरफेरॉन-प्रेरित प्रोटीन के पैनल के बीच उपन्यास प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की पहचान की जा सकती है।प्रोटीन कॉम्प्लेक्स को पकड़ने के लिए इंटरफेरॉन-रेस्पॉन्सिव फ़्लो-1 सेल मॉडल में वैश्विक प्रोटीन क्रॉस-लिंकिंग विश्लेषण का उपयोग किया गया था।गैर-क्रॉस-लिंक्ड और क्रॉस-लिंक्ड कोशिकाओं से ट्राइप्टिक पेप्टाइड्स का निष्कर्षण पेप्टाइड गिनती, मार्ग संवर्धन और परिभाषित एलएफक्यू तीव्रता के साथ पेप्टाइड लंबाई वितरण की अनुमति देता है।कैनोनिकल इंटरफेरॉन-इंड्यूसिबल प्रोटीन को एक सकारात्मक आंतरिक नियंत्रण के रूप में पहचाना गया, जबकि एमएक्स1, यूपी18, ओएएस3 और एसटीएटी1 जैसे कैनोनिकल इंटरफेरॉन-इंड्यूसिबल प्रोटीन के नए इंटरमॉलिक्युलर और इंट्रामोल्युलर क्रॉस-लिंक्ड एडक्ट देखे गए।कार्यात्मक क्षेत्रों में विभिन्न संरचनात्मक विशेषताओं और अंतःक्रियाओं की जांच की गई है।
IFNα से उपचारित और अनुपचारित फ़्लो-1 और A549 कोशिकाओं में इम्युनोब्लॉटिंग द्वारा HLA-A, MDN1 और H2B के बीच परस्पर क्रिया का पता लगाया गया।हमारे परिणाम इस बात पर प्रकाश डालते हैं कि HLA-A IFNα-निर्भर तरीके से H2B के साथ मिश्रित होता है।हमारा काम इन दो परिसरों के सह-स्थानीयकरण की आगे की खोज के लिए एक दिलचस्प अवसर का प्रतिनिधित्व करता है।सेल-प्रकार-स्वतंत्र इंटरफेरॉन-मध्यस्थ प्रोटीन इंटरैक्शन की पहचान करने के लिए सेल लाइनों के एक पैनल में सीएलएमएस दृष्टिकोण का विस्तार करना भी दिलचस्प होगा।अंत में, हमने H2BFS-HLA-A-HMGA1 कॉम्प्लेक्स में शामिल प्रोटीन की गठनात्मक गतिशीलता को समझने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में एमडी मॉडलिंग का उपयोग किया, जो इंट्रामोल्युलर और इंटरमॉलिक्युलर क्रॉस-टॉक को ट्रैक करता था।सीएलएमएस डेटा के निष्कर्ष एच2बीएफएस, एचएलए-ए और एचएमजीए1 प्रोटीन की विभिन्न संरचना की संभावना का सुझाव देते हैं।इन डॉकिंग प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के बीच संभावित भिन्न अनुरूपताओं से सीएलएमएस डेटासेट में देखे गए समान कई इंटरैक्शन का पता चला।हमारी पद्धति की मुख्य शक्तियों में से एक यह है कि यह एचएलए जैसे अत्यधिक बहुरूपी जीनों की परस्पर क्रिया की आसान पहचान की अनुमति देती है, इसलिए एचएलए हैप्लोटाइप-विशिष्ट प्रोटीनों की अंतःक्रियाओं का अध्ययन करना दिलचस्प होगा जिनका अध्ययन करना अन्यथा कठिन है।कुल मिलाकर, हमारा डेटा प्रदर्शित करता है कि सीएलएमएस का उपयोग इंटरफेरॉन-प्रेरित सिग्नलिंग नेटवर्क की हमारी समझ का विस्तार करने और ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में अधिक जटिल इंटरसेलुलर सिस्टम का अध्ययन करने के लिए आधार प्रदान करने के लिए किया जा सकता है।
फ़्लो-1 कोशिकाओं को एटीसीसी से प्राप्त किया गया और डीएमईएम (गिब्को) में 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (इन्विट्रोजन), 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (गिब्को) के साथ रखा गया और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर संग्रहीत किया गया।ऊष्मायन.IFNα14 (एडिनबर्ग प्रोटीन उत्पादन सुविधा द्वारा निर्मित) के साथ इलाज करने से पहले कोशिकाओं को 70-80% संगम तक विकसित किया गया था।जब तक अन्यथा उल्लेख न किया गया हो, अन्य सभी रसायन और अभिकर्मक सिग्मा एल्ड्रिच से खरीदे गए थे।
फ़्लो-1 कोशिकाओं को 6-अच्छी तरह से प्लेटों में संवर्धित किया गया और अगले दिन कोशिकाओं को लगभग 80% संगम तक 24 घंटे के लिए 10 एनजी/एमएल IFNα14 के साथ इलाज किया गया।कोशिकाओं को पीबीएस के साथ तीन बार धोया गया और पीबीएस में ताजा तैयार डीएसएस (थर्मो फिशर साइंटिफिक) (डीएमएसओ में भंग) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 0.5 मिमी की अंतिम सांद्रता तक लिगेट किया गया।डीएसएस क्रॉसलिंकिंग प्रतिक्रिया को पीबीएस के साथ बदल दिया गया था और 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए पीबीएस में 20 मिमी ट्रिस (पीएच 8.0) जोड़कर अवशिष्ट डीएसएस को बुझाया गया था।कोशिकाओं को स्क्रैप करके कम बाइंडिंग ट्यूब (ऑक्सीजन) में एकत्रित किया गया।
सेल गोली को कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए कभी-कभी झटकों के साथ 300 μl यूरिया लाइसिस बफर (8 एम यूरिया, 0.1 एम ट्रिस, पीएच 8.5) के साथ लीज किया गया था।सभी सेंट्रीफ्यूजेशन चरण 14,000 xg पर 8°C पर किए गए।10 मिनट के लिए लाइसेट को सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरनेवाला को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें।शेष स्पष्ट कणों को एक सजातीय जलीय घोल प्राप्त होने तक 30 मिनट या उससे अधिक के लिए दूसरे लाइसिस बफर (2 एम यूरिया, 2% (डब्ल्यू/वी) एसडीएस (सोडियम डोडेसिल सल्फेट)) के 150 μl में भंग कर दिया गया था।लाइसेट को 20 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज किया गया और सतह पर तैरनेवाला को पिछले चरण में प्राप्त लाइसेट के साथ मिलाया गया।माइक्रोप्लेट प्रक्रियाओं के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार माइक्रो बीसीए परख (थर्मो फिशर साइंटिफिक) का उपयोग करके प्रोटीन सांद्रता का मूल्यांकन किया गया था।नमूनों को तुरंत तरल नाइट्रोजन में जमा दिया गया और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया।
लगभग 100 μg घुलनशील क्रॉस-लिंक्ड प्रोटीन को संशोधित निस्पंदन नमूना तैयारी प्रोटोकॉल (एफएएसपी) का उपयोग करके संसाधित किया गया था जैसा कि विस्निवस्की एट अल द्वारा वर्णित है।69 संक्षेप में, प्रोटीन को 200 μl यूरिया बफर (0.1 एम ट्रिस में 8 एम यूरिया, पीएच 8.5) के साथ क्रॉसलिंक किया गया है, भंवर में डाला गया है और आधा किया गया है।सभी सेंट्रीफ्यूजेशन चरण 14,000 xg पर 25°C पर किए गए।क्रॉस-लिंक्ड प्रोटीन लाइसेट के पहले आधे भाग को अल्ट्रासेल-10 झिल्ली (मर्क) से सुसज्जित 10 केडीए माइक्रोकॉन सेंट्रीफ्यूगल फिल्टर डिवाइस में स्थानांतरित किया गया, इसके बाद 25 मिनट के लिए फिल्टर पर सेंट्रीफ्यूजेशन किया गया।फिर प्रोटीन का दूसरा भाग फ़िल्टर में डालें और वही चरण दोहराएँ।यूरिया बफर में 17 एमएम ट्रिस (2-कार्बोक्सीथाइल) फॉस्फीन हाइड्रोक्लोराइड (टीसीईपी) के 100 μl जोड़कर प्रोटीन रिकवरी की गई।रिकवरी को थर्मोमिक्सर पर 600 आरपीएम पर 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए हिलाया गया।इसके अलावा, कॉलम को सेंट्रीफ्यूज किया गया था और यूरिया बफर में 50 मिमी आयोडोएसिटामाइड के 100 μl का उपयोग करके कम क्रॉस-लिंक्ड प्रोटीन को एल्काइलेट किया गया था।एल्किलेशन प्रतिक्रिया कमरे के तापमान पर 20 मिनट तक अंधेरे में की गई।कॉलम को घुमाएं, कॉलम की दीवारों को 100 μl यूरिया बफर से 3 बार धोएं, और फिर सेंट्रीफ्यूज करें।100 मिमी अमोनियम बाइकार्बोनेट के 100 μl का उपयोग करके एक ही ऑपरेशन 3 बार किया गया था।ट्रिप्सिनाइजेशन से पहले, संग्रह ट्यूब को एक नए से बदलें।ट्रिप्सिन बफर (पेमरेगा) में पतला 50 एमएम अमोनियम बाइकार्बोनेट और 1 μl ट्रिप्सिन युक्त पाचन बफर जोड़ें।ट्रिप्सिन और प्रोटीन का अनुपात लगभग 1:33 पर बनाए रखा गया था, और पाचन प्रतिक्रियाओं को एक आर्द्र कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर रखा गया था।क्रॉसलिंक्ड पेप्टाइड को 25 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा फिल्टर से निकाला गया था।फिल्टर में 0.5 एम NaCl के 50 μl जोड़कर, इसके बाद 25 मिनट तक सेंट्रीफ्यूजेशन करके पेप्टाइड रिकवरी में सुधार किया गया।
C18 माइक्रो स्पिन कॉलम (हार्वर्ड उपकरण) का उपयोग मामूली संशोधनों के साथ बौचल एट अल.70 द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करते हुए क्रॉस-लिंक्ड ट्राइप्टिक पेप्टाइड्स को डीसेल्ट करने के लिए किया गया था।संक्षेप में, सी18 स्पिन कॉलम को एसीटोनिट्राइल (एसीएन) (मर्क) में 0.1% फॉर्मिक एसिड (एफए) के तीन वॉश और 0.1% एफए के दो वॉश के साथ सक्रिय किया गया था।स्तंभ को 15 मिनट के लिए 0.1% एफए के साथ हाइड्रेटेड किया गया था।नमूनों को स्पिन कॉलम में लोड करें और 0.1% एफए के साथ 3 बार धोएं।डीसाल्टेड पेप्टाइड्स को क्रमिक रूप से 0.1% एफए में 50%, 80% और 100% एसीएन का उपयोग करके चरणबद्ध ढाल के साथ निरूपित किया गया था।नमूनों को स्पीडवैक प्लस कंसंट्रेटर (एप्पेंडॉर्फ) में तब तक सुखाया गया जब तक कि बचा हुआ तरल पूरी तरह से गायब नहीं हो गया।उत्सर्जित पेप्टाइड्स को 2.5% एसीएन में 0.08% ट्राइफ्लूरोएसेटिक एसिड के 100 μl में भंग कर दिया गया था और सांद्रता को नैनोड्रॉप 2000 (थर्मो साइंटिफिक) पर मापा गया था।प्रति नमूना लगभग 1 μg क्रॉसलिंक्ड पेप्टाइड को LC-MS/MS प्रणाली में इंजेक्ट किया गया था।
क्रॉस-लिंक्ड पेप्टाइड्स को ऑर्बिट्रैप एक्सप्लोरिस 480 मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो साइंटिफिक) से जुड़े अल्टिमेट 3000 आरएसएलसीनैनो एलसी सिस्टम (थर्मो साइंटिफिक) पर अलग किया गया था।क्रॉस-लिंक्ड पेप्टाइड्स को 300 µm आईडी, 5 मिमी लंबे µ-प्री-कॉलम C18 कैप्चर कॉलम पर C18 PepMap100 सॉर्बेंट और 5 µm PepMap सॉर्बेंट (थर्मो साइंटिफिक) के साथ पैक किया गया था।पंप प्रवाह सेट को 5 μl/मिनट पर लोड करें 0.08% ट्राइफ्लूरोएसिटिक एसिड 2.5% AcN में घुला हुआ।क्रॉस-लिंक्ड पेप्टाइड्स को 75 μm के आंतरिक व्यास और 150 मिमी की लंबाई के साथ एक विश्लेषणात्मक फ़्यूज्ड सिलिका कॉलम पर अलग किया गया था, जो 2 μm पेपमैप सॉर्बेंट (थर्मो साइंटिफिक) से भरा हुआ था।मोबाइल चरण ए और बी में क्रमशः पानी में 0.1% एफए और एसीटोनिट्राइल में 0.1% एफए शामिल थे।ग्रेडिएंट 2.5% बी से शुरू होता है और 90 मिनट में रैखिक रूप से 40% बी तक बढ़ जाता है, फिर अगले 2 मिनट में 90% बी तक।मोबाइल चरण संरचना को 10 मिनट के लिए 90% बी पर बनाए रखा गया और फिर 2 मिनट में रैखिक रूप से घटकर 2.5% बी हो गया।अगले चक्र से पहले 8 मिनट के लिए कॉलम को 2.5% बी पर संतुलित किया गया था।विश्लेषणात्मक स्तंभ से निकलने वाले क्रॉस-लिंक्ड पेप्टाइड्स को नैनोइलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (एनएसआई) स्रोत में आयनित किया गया और एक्सप्लोरिस 480 मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो साइंटिफिक) में इंजेक्ट किया गया।
ऑर्बिट्रैप एक्सप्लोरिस 480 मास स्पेक्ट्रोमीटर सकारात्मक डेटा सहसंबंध मोड में संचालित होता है।एक पूर्ण स्कैन अनुभाग मोड में 120,000 के रिज़ॉल्यूशन पर m/z 350 Th से m/z 2000 Th तक की रेंज सेटिंग्स के साथ किया गया था।सामान्यीकृत एजीसी लक्ष्य 50 एमएस के अधिकतम इनपुट समय के साथ 300% पर निर्धारित किया गया था।पेप्टाइड्स के लिए मोनोआइसोटोपिक शिखर का पता लगाना स्थापित किया गया है।यदि बहुत कम पूर्वगामी पाए जाते हैं तो बाधा विश्राम पैरामीटर सत्य पर सेट हो जाता है।अग्रदूत की न्यूनतम आयनिक शक्ति 5.0e3 पर सेट की गई थी और प्रयोगों में +8 तक पूर्ववर्ती चार्ज अवस्थाओं को शामिल किया गया था।
डेटा सहसंबंध मोड में प्रमुख स्कैन के बीच चक्र का समय 2.5 सेकंड निर्धारित किया गया था।पूर्ववर्ती आयन के पहले विखंडन के बाद गतिशील द्रव्यमान बहिष्करण को 20 एस पर सेट किया गया था।प्रीकर्सर आइसोलेशन विंडो को 2 Th पर सेट किया गया था।एक निश्चित टकराव ऊर्जा मोड के साथ सामान्यीकृत टकराव ऊर्जा का प्रकार डेटा पर निर्भर एमएस/एमएस स्कैन में चुना गया था।टकराव ऊर्जा 30% पर सेट।ऑर्बिट्रैप रिज़ॉल्यूशन 15,000 और एजीसी लक्ष्य 100% पर सेट किया गया था।कस्टम अधिकतम इंजेक्शन समय 60 मिलीसेकंड पर सेट है।
क्रॉस-लिंक्ड नमूनों में प्रोटीन-प्रोटीन नेटवर्क को ट्रैक करने से पहले, हमने नमूनों में ट्रेस करने योग्य पेप्टाइड्स/प्रोटीन की पहचान करने के लिए मैक्सक्वांट पैकेज (संस्करण 1.6.12.0)26,27 का उपयोग करके कच्ची फ़ाइलों को संसाधित किया।इसके अलावा, IFNα से उपचारित और अनुपचारित अनक्रॉसलिंक्ड फ़्लो-1 नमूनों पर समान प्रोटिओमिक विश्लेषण किए गए थे।अंतर्निहित खोज इंजन एंड्रोमेडा27 का उपयोग करके एमएस/एमएस डेटा को यूनीप्रोट मानव डेटाबेस (www.uniprot.org) (12 अगस्त, 2020 को अपलोड किया गया, जिसमें 75,093 प्रविष्टियां हैं) में खोजा गया था।खोज एंजाइम की विशिष्टता और डीमिडेशन (एन, क्यू) और ऑक्सीकरण (एम) के विभिन्न संशोधनों को इंगित किए बिना की गई थी।पूर्ववर्ती द्रव्यमान सहनशीलता 20 पीपीएम पर और उत्पाद आयन 0.02 दा पर निर्धारित किए गए थे।प्रारंभिक और अधिकतम द्रव्यमान विचलन 10 पीपीएम पर सेट किया गया था।पेप्टाइड का अधिकतम द्रव्यमान 4600 दा निर्धारित किया गया था और अनुक्रम समानता 7 और 25 अमीनो एसिड (एए) के बीच निर्धारित की गई थी।आगे का सांख्यिकीय विश्लेषण पर्सियस प्रोग्राम (संस्करण 1.6.10.45) का उपयोग करके किया गया था।प्रोटीन सामग्री की गणना प्रोटीन की वर्णक्रमीय तीव्रता (एलएफक्यू तीव्रता; अनलेबल मात्रा का ठहराव)27 को सामान्य करके की गई थी और तीव्रता मूल्यों को लॉग2 में परिवर्तित किया गया था।आर (v 4.1.2) में फेटमैप (v1.0.12) पैकेज का उपयोग करके उनकी पेप्टाइड तीव्रता द्वारा पहचाने गए प्रोटीन का एक पदानुक्रमित क्लस्टरिंग बनाया गया था।IFNα-उपचारित प्रोटीन के लिए रिएक्टोम पाथवे डेटाबेस का उपयोग करके पाथवे संवर्धन विश्लेषण किया गया था जो अनुपचारित नमूनों की तुलना में चार गुना से अधिक सक्रिय थे।
एलसी-एमएस/एमएस द्वारा मॉनिटर किए गए प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के विशिष्ट रासायनिक क्रॉसलिंक लाइसिन (के) या सेरीन (एस) की पहचान क्रॉस-लिंक्ड पेप्टाइड्स (सिम-एक्सएल) 29 के लिए स्पेक्ट्रोस्कोपिक पहचान मशीन (सिम-एक्सएल) का उपयोग करके की गई थी।सबसे पहले, इंटरफेरॉन-संबद्ध (आईएफएन) डीएनए क्षति प्रतिरोध हस्ताक्षर (आईआरडीएस) जीन के बीच संभावित बातचीत की जांच पडारिया एट अल.28 में वर्णित आईआरडीएस प्रोटीन डेटासेट का उपयोग करके की गई थी।संपूर्ण मानव UniProt की सभी स्थितियों और दोहराव की स्क्रीनिंग कम्प्यूटेशनल रूप से गहन है, इसलिए IFNα-उपचारित दोहराव के विरुद्ध संपूर्ण मानव UniProt डेटाबेस (www.uniprot.org) (12 अगस्त 2020 को डाउनलोड किया गया, इसमें 75,093 प्रविष्टियाँ हैं)।उच्च भरोसेमंद इंटरैक्शन के लिए फ़िल्टर में से एक।प्राप्त इन उच्च-महत्वपूर्ण इंटरैक्शन का सभी पुनरावृत्तियों और स्थितियों में विस्तार और परीक्षण किया गया।
सिम-एक्सएल में, डीएसएस का उपयोग क्रॉसलिंकर (एक्सएल) के लिए किया गया था और एक्सएल वेट शिफ्ट और संशोधन वेट शिफ्ट को क्रमशः 138.06 और 156.07 पर सेट किया गया था।निम्नलिखित क्रॉसलिंकिंग प्रतिक्रिया साइटों पर विचार किया जाता है: केके, केएस और केएन-टर्म, रिपोर्टर आयनों के बिना।अग्रदूत और खंड पीपीएम दोनों को 20 पर सेट किया गया था और एक्सरिया थ्रेशोल्ड को 0.15 पर सेट किया गया था।ट्रिप्सिन को पूरी तरह से विशिष्ट माना गया, और एक उच्च-ऊर्जा सी-ट्रैप (एचसीडी) विखंडन विधि लागू की गई।XCorr डायनेमिक DB कमी सीमा और डायनेमिक DB कमी के लिए पेप्टाइड्स की न्यूनतम संख्या क्रमशः 2.5 और 2 पर सेट की गई थी।अन्य पैरामीटर हैं: मोनोआइसोटोप संभावना और शिखर संयोग कटऑफ, प्रति स्ट्रैंड न्यूनतम 4 एए अवशेष और अधिकतम स्ट्रैंड चार्ज, और मिस्ड स्प्लिट्स की 3 अधिकतम सीमा।परिणामी सिले हुए 2डी मानचित्रों का विश्लेषण (सिम-एक्सएल) में किया गया और 2डी मानचित्र बनाने के लिए xQuest28 ग्राफिकल प्रतिनिधित्व का उपयोग किया गया।प्रोटीन संरचनाओं पर प्रोटीन क्रॉसलिंक PyMol (PyMOL आणविक ग्राफिक्स सिस्टम, संस्करण 2.0 श्रोडिंगर, LLC) में प्रदान किए जाते हैं।
होमोलॉजी मॉडलिंग के सिद्धांतों और "हिडन मार्कोव विधि" के कार्यान्वयन का उपयोग करके Phyre2 सर्वर (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 का उपयोग करके प्रोटीन मॉडल संरचनाएं बनाई गईं।Phyre2 ज्ञात प्रोटीन संरचनाओं के साथ अनुक्रम संरेखण के आधार पर मॉडल संरचनाएं उत्पन्न करता है।H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4, और MDN1 प्रोटीन के लिए, टेम्पलेट संरचनाएं 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62, और 6i2665 का उपयोग किया गया था।इसके अलावा, अल्फाफोल्ड71 एमएक्स1, यूबीपी18 और आरओबीओ1 की संरचना पर भी विचार किया गया।प्रोटीन संरचना की कल्पना BIOVIA डिस्कवरी स्टूडियो विज़ुअलाइज़र पैकेज (डसॉल्ट सिस्टम्स, BIOVIA, सैन डिएगो, CA, यूएसए) और आणविक ऑपरेटिंग पर्यावरण पैकेज (MOE; केमिकल कंप्यूटिंग ग्रुप इंक, मॉन्ट्रियल, क्यूबेक, कनाडा) का उपयोग करके की गई थी।