एएसटीएम ए790 2507/2205 1.4462/1.4410 रासायनिक उद्योग रासायनिक घटक के लिए डुप्लेक्स वेल्डेड ट्यूब, एसपीईसीसी1एल की कमी से स्प्लिस्ड जोड़ों की स्थिरता में वृद्धि होती है और कपाल तंत्रिका शिखा कोशिकाओं का बहाव कम हो जाता है।

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रासायनिक उद्योग के लिए एएसटीएम ए790 2507/2205 1.4462/1.4410 डुप्लेक्स वेल्डेड ट्यूब

लियाओचेंग सिहे एसएस मटेरियल कंपनी लिमिटेडएक अग्रणी निर्माता है जो स्टेनलेस स्टील सीमलेस पाइप, ब्राइट एनील्ड ट्यूब, सीमलेस कॉइल्ड ट्यूबिंग आदि में विशेषज्ञता रखता है।ग्राहकों की सुविधा के लिए, हमारे पास वेल्डेड पाइप और ट्यूब भी हैं।लियाओचेंग सिहे एसएस मटेरियल कंपनी लिमिटेडके पास सबसे उन्नत उत्पादन और परीक्षण उपकरण हैं।हम आपकी आवश्यकता को पूरी तरह से पूरा कर सकते हैं।मानक के अनुसार बहुत सख्ती से, हमारे द्वारा उत्पादित ट्यूबों में हमेशा सही ओडी और डब्ल्यूटी सहनशीलता होती है।सहनशीलता नियंत्रण कड़ाई से उत्पादन मानकों के अनुसार है।हमारे उत्पाद ग्राहकों को हमेशा संतुष्ट करते हैं।ग्राहकों ने हमारे उत्पाद खरीदे और अधिक मुनाफा कमाया।
ए) ओडी (बाहरी व्यास): 3.18 मिमी से 101.6 मिमी
बी) डब्ल्यूटी (दीवार की मोटाई): 0.5 मिमी से 20 मिमी
ग) लंबाई: ग्राहक की आवश्यकता के अनुसार
घ) मानक: एएसटीएम ए312;एएसटीएम ए269;एएसटीएम ए789;एएसटीएम ए790 आदि
ई) प्रक्रिया विधि: ईआरडब्ल्यू, ईएफडब्ल्यू आदि

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कपाल तंत्रिका शिखा कोशिकाएं (सीएनसीसी) भ्रूण के तंत्रिका सिलवटों को हटा देती हैं और ग्रसनी मेहराब की ओर स्थानांतरित हो जाती हैं, जो अधिकांश मध्य भाग संरचनाओं का निर्माण करती हैं।सीएनसीसी डिसफंक्शन ओरोफेशियल फांक, एक सामान्य जन्मजात विकृति, के एटियलजि में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।असामान्य और सिन्ड्रोमिक फांक वाले रोगियों में विषमयुग्मजी SPECC1L उत्परिवर्तन पाए गए हैं।यहां, हम सुसंस्कृत SPECC1L नॉकडाउन कोशिकाओं में कैनोनिकल चिपकने वाले जंक्शन (एजे) घटकों, β-कैटेनिन और ई-कैडरिन के बढ़े हुए धुंधलापन की रिपोर्ट करते हैं, और इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ एजे के एपिकल-बेसल प्रसार को दिखाते हैं।क्रैनियोफेशियल मॉर्फोजेनेसिस में SPECC1L की भूमिका को समझने के लिए, हमने Specc1l की कमी वाला माउस मॉडल बनाया।समयुग्मक उत्परिवर्ती भ्रूण के लिए घातक होते हैं और न्यूरल ट्यूब बंद होने और सीएनसीसी लेमिनेशन में बाधा उत्पन्न करते हैं।उत्परिवर्ती तंत्रिका सिलवटों में एजे प्रोटीन का धुंधलापन बढ़ जाता है।यह एजे दोष सीएनसीसी प्रदूषण में दोष के अनुरूप है, जिसके लिए एजे विघटन की आवश्यकता होती है।इसके अलावा, Specc11 म्यूटेंट ने PI3K-AKT सिग्नलिंग को कम कर दिया है और एपोप्टोसिस को बढ़ा दिया है।इन विट्रो में, जंगली प्रकार की कोशिकाओं में PI3K-AKT सिग्नलिंग का हल्का अवरोध AJ परिवर्तनों को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त था।महत्वपूर्ण बात यह है कि SPECC1L नॉकडाउन से प्रेरित AJ परिवर्तनों को PI3K-AKT मार्ग के सक्रियण द्वारा उलटा किया जा सकता है।कुल मिलाकर, इन आंकड़ों से पता चलता है कि SPECC1L, PI3K-AKT सिग्नलिंग और AJ जीव विज्ञान के एक नए नियामक के रूप में, न्यूरल ट्यूब बंद करने और CNCC स्तरीकरण के लिए आवश्यक है।
कपाल तंत्रिका शिखा कोशिकाएं (CNCCs) पृष्ठीय न्यूरोएक्टोडर्म में स्थानीयकृत होती हैं और एपिथेलियल-मेसेनकाइमल संक्रमण (EMT)1,2,3 से जुड़ी एक प्रक्रिया के माध्यम से विकासशील तंत्रिका सिलवटों के न्यूरोएपिथेलियम से अलग हो जाती हैं।प्रीमिग्रेटिंग एपिथेलियल सीएनसीसी अंतरकोशिकीय जंक्शनों को बाधित करते हैं और माइग्रेटिंग मेसेनकाइमल सीएनसीसी बन जाते हैं जो पहले और दूसरे ग्रसनी मेहराब को भरते हैं और अधिकांश क्रैनियोफेशियल उपास्थि बनाते हैं।इस प्रकार, सीएनसीसी फ़ंक्शन को नियंत्रित करने वाले जीन अक्सर क्रैनियोफेशियल जन्मजात विसंगतियों जैसे ओरोफेशियल क्लीफ्ट्स के एटियलजि में बाधित होते हैं, जो आमतौर पर अकेले अमेरिका में 1/800 जन्मों को प्रभावित करते हैं।जन्मजात विकृतियों में से एक8.
सीएनसीसी का प्रदूषण चूहों में भ्रूण के विकास के 8.5 और 9.5 दिनों के बीच पूर्वकाल तंत्रिका ट्यूब के बंद होने के साथ मेल खाता है।कई माउस ओरोफेशियल फांक-संबंधी जीनों के उत्परिवर्ती भी कुछ प्रकार के न्यूरल ट्यूब दोष प्रदर्शित करते हैं, जिनमें Irf69,10, Ghrl310, Cfl111, और Pdgfrα12 शामिल हैं।हालाँकि, न्यूरल ट्यूब बंद होने और सीएनसीसी स्तरीकरण की प्रक्रियाओं को स्वतंत्र माना जा सकता है, क्योंकि स्प्लोच म्यूटेंट माउस (Pax3) सीएनसीसी स्तरीकरण या माइग्रेशन 13,14 पर किसी भी प्रभाव के बिना न्यूरल ट्यूब बंद होने में दोष प्रदर्शित करता है।सीएनसीसी विच्छेदन और न्यूरल ट्यूब बंद होने में दोष वाले अतिरिक्त माउस मॉडल इन दो प्रक्रियाओं के सामान्य आणविक आधार को चित्रित करने में मदद करेंगे।
न्यूरोएपिथेलियल कोशिकाओं से सीएनसीसी के अलगाव के लिए चिपकने वाले जंक्शनों (एजे) के विघटन की आवश्यकता होती है, जो प्रोटीन कॉम्प्लेक्स से बने होते हैं, जिनमें ई-कैडरिन, β-कैटेनिन, α-ई-कैटेनिन और एक्टिन फिलामेंट्स से जुड़े α-एक्टिनिन शामिल होते हैं। तंत्रिका सिलवटों में ई-कैडरिन के अतिअभिव्यक्ति अध्ययन से सीएनसीसी प्रदूषण में कमी या देरी देखी गई।इसके विपरीत, ई-कैडरिन के दमन के परिणामस्वरूप प्रारंभिक स्तरीकरण होता है15,16।सीएनसीसी स्तरीकरण के दौरान ईएमटी में मध्यस्थता करने वाले कई कारक प्रतिलेखन कारक (एपी2α, आईडी2, एफओएक्सडी3, एसनेल, ट्विस्ट, एसओएक्स10) और मैट्रिक्स मेटालोप्रोटीनिस (एमएमपी) जैसे बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) रीमॉडलिंग प्रोटीन हैं, हालांकि सीएनसीसी प्रत्यक्ष साइटोस्केलेटल एजे नियामक हैं। अभी तक ज्ञात नहीं है.PI3K-AKT मार्ग को मुख्य रूप से कैंसर अनुसंधान17 से ई-कैडरिन स्तरों को रोकने के लिए जाना जाता है।हाल के अध्ययनों से पता चला है कि चूहों में PDGFα-आधारित PI3K-AKT सिग्नलिंग के नुकसान से क्रानियोफेशियल असामान्यताएं होती हैं, जिनमें फांक तालु और न्यूरल ट्यूब दोष12 शामिल हैं।हालाँकि, PI3K-AKT मार्ग और CNCC स्तरीकरण पर AJ स्थिरता के बीच संबंध स्पष्ट नहीं है।
हमने पहले SPECC1L को दो लोगों में पहले उत्परिवर्ती जीन के रूप में पहचाना था, जिनके मुंह से आंख तक गंभीर फांक था, जिसे ओब्लिक फांक (ओबीएफसी) या टेसियर IV18 फांक के रूप में जाना जाता था।ऑटोसोमल प्रमुख ओपिट्ज़ जी/बीबीबी सिंड्रोम (ओएमआईएम #145410) वाले दो बहु-पीढ़ीगत परिवारों में एसपीईसीसी1एल उत्परिवर्तन की पहचान की गई है, जिसमें प्रभावित व्यक्तियों में हाइपरडिस्टेंस और कटे होंठ/तालु19 प्रदर्शित हुए हैं, और एक परिवार में टिबी ओवरडिस्टेंस सिंड्रोम (ओएमआईएम #145420)20 है। .ओपिट्ज़ जी/बीबीबी सिंड्रोम के आधे से अधिक मामले एक्स-लिंक्ड (ओएमआईएम #300000) हैं और एमआईडी1 जीन में उत्परिवर्तन के कारण होते हैं, जो सूक्ष्मनलिका से जुड़े कोशिका कंकाल के प्रोटीन 22 को एन्कोड करता है।हम परिकल्पना करते हैं कि SPECC1L, सूक्ष्मनलिकाएं और एक्टिन साइटोस्केलेटन से जुड़ा एक प्रोटीन, कोशिका आसंजन और माइग्रेशन 18 के दौरान एक्टिन साइटोस्केलेटन रीमॉडलिंग के लिए आवश्यक सिग्नलिंग में मध्यस्थता कर सकता है।इन विट्रो और विवो अध्ययनों के माध्यम से, अब हम SPECC1L को PI3K-AKT सिग्नलिंग के माध्यम से AJ स्थिरता के एक उपन्यास नियामक के रूप में वर्णित करते हैं।सेलुलर स्तर पर, SPECC1L की कमी के परिणामस्वरूप पैन-AKT प्रोटीन के स्तर में कमी आई और AJ के एपिकल-बेसल फैलाव में वृद्धि हुई, जिसे AKT मार्ग के रासायनिक सक्रियण द्वारा समाप्त कर दिया गया।विवो में, Specc11 की कमी वाले भ्रूण में न्यूरल ट्यूब बंद होने और सीएनसीसी विच्छेदन में कमी देखी गई है।इस प्रकार, SPECC1L चेहरे की आकृति विज्ञान के दौरान सामान्य CNCC फ़ंक्शन के लिए आवश्यक अत्यधिक विनियमित सेल आसंजन-आधारित सिग्नलिंग में कार्य करता है।
सेलुलर स्तर पर SPECC1L की भूमिका को चिह्नित करने के लिए, हमने SPECC1L18 में पहले वर्णित स्थिर ऑस्टियोसारकोमा सेल लाइन U2OS की कमी का उपयोग किया।SPECC1L (kd) नॉकडाउन के साथ इन स्थिर U2OS कोशिकाओं में SPECC1L ट्रांसक्रिप्ट और प्रोटीन के स्तर में मध्यम (60-70%) की कमी हुई, साथ ही एक्टिन साइटोस्केलेटन 18 के माइग्रेशन और पुनर्गठन में दोष भी थे। इसके विपरीत, एक गंभीर क्षणिक कमी SPECC1L को माइटोटिक दोष 23 को जन्म देने वाला दिखाया गया है।आगे लक्षण वर्णन करने पर, हमने पाया कि हमारी स्थिर SPECC1L-kd कोशिकाओं ने बहुत उच्च स्तर के संगम पर आकृति विज्ञान को बदल दिया है (चित्र 1)।कम संगम पर व्यक्तिगत नियंत्रण कोशिकाएं और केडी कोशिकाएं समान दिखती थीं (चित्र 1ए,डी)।संलयन के 24 घंटे बाद, नियंत्रण कोशिकाओं ने अपना घनाकार आकार बनाए रखा (चित्र 1बी, ई), जबकि SPECC1L-kd कोशिकाएं लंबी हो गईं (चित्र 1सी, एफ)।कोशिका के आकार में इस परिवर्तन की सीमा को नियंत्रण कोशिकाओं और केडी कोशिकाओं की विवो लाइव इमेजिंग द्वारा कैप्चर किया गया था (मूवी 1)।संगम कोशिकाओं में SPECC1L की भूमिका निर्धारित करने के लिए, हमने पहले इसकी अभिव्यक्ति की जांच की।हमने पाया कि SPECC1L प्रोटीन का स्तर संलयन पर बढ़ गया (चित्र 1G), जबकि SPECC1L प्रतिलेख स्तर में वृद्धि नहीं हुई (चित्र 1H)।इसके अलावा, जैसे-जैसे कोशिका घनत्व बढ़ता गया, SPECC1L प्रोटीन अंतरकोशिकीय सीमाओं (चित्र 2A-E) पर जमा होता गया, जिसका पैटर्न झिल्ली से जुड़े β-कैटेनिन (चित्र 2A'-E') के साथ अतिव्यापी होता है।एक्टिन साइटोस्केलेटन 18,23 के साथ SPECC1L के जुड़ाव को देखते हुए हमने अनुमान लगाया कि SPECC1L एक्टिन-आधारित चिपकने वाले जंक्शनों (AJ) के साथ इंटरैक्ट करता है।
(एएफ) एसपीईसीसी1एल नॉकडाउन (डीएफ) कोशिकाएं नियंत्रण यू2ओएस कोशिकाओं (एसी) की तुलना में उच्च संगम (एफ) पर लंबी हो जाती हैं।यहां छह में से तीन समय बिंदु (टी1, टी3, टी6) दिखाए गए हैं जिन्हें हमने विभिन्न सेल घनत्वों के लिए चुना है।(जी) पश्चिमी धब्बा विश्लेषण से पता चलता है कि SPECC1L प्रोटीन नियंत्रण कोशिकाओं में संगम की निम्न डिग्री की तुलना में उच्च स्तर के संगम पर स्थिर होता है।SPECC1L का पश्चिमी धब्बा अपेक्षित 120 केडीए बैंड और एक उच्च आणविक भार बैंड दिखाता है, संभवतः अनुवाद के बाद संशोधित (*)।पश्चिमी धब्बा विश्लेषण निम्न और उच्च संगम के लिए समान परिस्थितियों में किया गया था।निम्न और उच्च संगम पर SPECC1L दिखाने वाली छवियां एक ही ब्लॉट से ली गई थीं।उसी धब्बा को हटा दिया गया और β-एक्टिन एंटीबॉडी के साथ दोबारा जांच की गई।(एच) मात्रात्मक आरटी-पीसीआर विश्लेषण ने SPECC1L प्रतिलेख स्तर में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं दिखाया।त्रुटि पट्टियाँ चार स्वतंत्र प्रयोगों से SEM का प्रतिनिधित्व करती हैं।
(एई) हमने एसपीईसीसी1एल नॉकडाउन (केडी) के साथ यू2ओएस कोशिकाओं में सेल आकार विश्लेषण और एजे परिवर्तनों को सामान्य करने के लिए सेल घनत्व की एक श्रृंखला का प्रतिनिधित्व करने वाले छह समय बिंदु (टी1-टी6) को चुना।इनमें से पहले पाँच समय बिंदुओं में एकल कोशिकाएँ (T1), छोटे कोशिका समूहों का 50-70% संलयन (T2), kd कोशिकाओं को पुनः आकार दिए बिना संलयन (T3), kd कोशिकाओं को पुनः आकार देना (T4), और 24 घंटे परिवर्तन शामिल हैं।kd (T5) कोशिकाओं के पश्च रूप में।SPECC1L प्रोटीन मुख्य रूप से T1 (A) पर साइटोप्लाज्म में फैला हुआ था, लेकिन इसका संचय बाद के समय बिंदुओं (B-E, तीर) पर अंतरकोशिकीय सीमाओं पर देखा गया था।(एफजे) β-कैटेनिन एजे कॉम्प्लेक्स से जुड़ी अंतरकोशिकीय सीमाओं पर समान संचय दिखाता है।(ए'-ई') SPECC1L और β-कैटेनिन उच्च सेल घनत्व (तीर) पर सेल सीमाओं पर अतिव्यापी धुंधलापन दिखाते हैं।(F'-J') SPECC1L-kd कोशिकाओं में, β-कैटेनिन धुंधलापन कम सेल घनत्व (F'-H') पर सामान्य दिखाई देता है, लेकिन सेल आकार में परिवर्तन (I', J'; तीर) के रूप में फैलता है, जो दर्शाता है कि AJ बदल गया।बार्स = 10 µm.
फिर हमने AJ पर SPECC1L की कमी के प्रभाव को निर्धारित करने का प्रयास किया।हमने कई एजे-संबंधित मार्करों का उपयोग किया, जिनमें विहित घटक एफ-एक्टिन, मायोसिन आईआईबी, β-कैटेनिन और ई-कैडरिन24,25,26,27 शामिल हैं।जैसा कि पहले बताया गया है SPECC1L-kd कोशिकाओं में एक्टिन तनाव फाइबर में वृद्धि हुई है (चित्र 3ए,बी) 18।एक्टिन फिलामेंट्स से जुड़े मायोसिन IIb ने इन विट्रो में SPECC1L-kd कोशिकाओं में समान वृद्धि देखी (चित्र 3C,D)।एजे-संबद्ध β-कैटेनिन कोशिका झिल्ली पर कैडेरिन से बंधता है, जो नियंत्रण क्यूबोसाइट्स में एक सामान्य "हनीकॉम्ब" अभिव्यक्ति पैटर्न दिखाता है (चित्र 3ई,जी)।दिलचस्प बात यह है कि कॉन्फ़ोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके सपाट छवियों में, β-कैटेनिन (छवि 3 ई, एफ) और ई-कैडरिन (छवि 3 जी, एच) संगम एसपीईसीसी 1 एल की कमी वाली कोशिकाओं की कोशिका झिल्ली पर धुंधलापन ने विस्तारित धुंधलापन के प्रमुख पैटर्न दिखाए।केडी कोशिकाओं में एजे-संबद्ध β-कैटेनिन धुंधलापन का यह विस्तार संगम पर सबसे अधिक स्पष्ट था, लेकिन कोशिका आकार में परिवर्तन से पहले दिखाई दिया (चित्र 2एफ-जे, एफ'-जे')।इस विस्तारित एजे धुंधलापन की भौतिक प्रकृति का निर्धारण करने के लिए, हमने ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) (चित्रा 3आई, जे) द्वारा एसपीईसीसी1एल-केडी यू2ओएस कोशिकाओं की एपिकल-बेसल सतह पर सेल सीमाओं की जांच की।नियंत्रण कोशिकाओं (छवि 3I) के विपरीत, जिसमें एजे (तीर) के संकेतक अलग-अलग इलेक्ट्रॉन घने क्षेत्र थे, केडी कोशिकाओं (चित्र 3जे) ने एपिकोबासल विमान के साथ एजे के संकेतक उच्च इलेक्ट्रॉन घनत्व के बड़े, सन्निहित क्षेत्र दिखाए।.इसके अलावा, अनुप्रस्थ खंडों पर, हमने केडी कोशिकाओं (छवि एस 1 ए, बी) में व्यापक कोशिका झिल्ली सिलवटों को देखा, जो β-कैटेनिन और ई-कैडरिन स्टेनिंग बैंड (छवि 3 एफ, एच) के विस्तारित पैटर्न की व्याख्या करता है।AJs में SPECC1L की भूमिका के समर्थन में, β-कैटेनिन को संगम U2OS कोशिकाओं (चित्र 3K) के लाइसेट्स में SPECC1L के साथ सह-प्रतिरक्षी अवक्षेपित किया गया था।एजे मार्करों के लिए विस्तारित इम्यूनोस्टेनिंग के साथ, टीईएम विश्लेषण हमारी परिकल्पना के अनुरूप था कि SPECC1L की कमी से एजे एपिकल-बेसल घनत्व और विचरण बढ़ जाता है।
(एएच) संलयन के 48 घंटे बाद केडी कोशिकाओं में एफ-एक्टिन धुंधलापन बढ़ गया (टी6; ए, बी)।एफ-एक्टिन (सी, डी) से जुड़े मायोसिन आईआईबी का बदला हुआ धुंधलापन।नियंत्रण कोशिकाओं (ई, जी) में β-कैटेनिन और ई-कैडरिन झिल्ली धुंधलापन का सुचारू पैटर्न SPECC1L-kd (एफ, एच) कोशिकाओं में बढ़ाया गया था।बार्स = 10 µm.(आई-जे) एपिकल-बेसल इंटरसेलुलर जंक्शन का अवलोकन करने वाले इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ।नियंत्रण कोशिकाएं अलग-अलग इलेक्ट्रॉन-सघन क्षेत्र दिखाती हैं जो चिपचिपे जंक्शनों (I, तीर) का संकेत देती हैं।इसके विपरीत, SPECC1L-kd कोशिकाओं में संपूर्ण एपिकल-बेसल जंक्शन इलेक्ट्रॉन सघन (जे, तीर) दिखाई दिया, जो चिपकने वाले जंक्शनों के बढ़े हुए घनत्व और फैलाव का संकेत देता है।(K) β-कैटेनिन को संगम U2OS सेल लाइसेट्स में SPECC1L के साथ सह-प्रतिरक्षी अवक्षेपित किया गया था।एक स्थान से ली गई छवि चार स्वतंत्र प्रयोगों में से एक का प्रतिनिधित्व करती है।
क्रैनियोफेशियल मॉर्फोजेनेसिस में SPECC1L की भूमिका को समझने के लिए, हमने दो स्वतंत्र ES ट्रैप सेल लाइनों, DTM096 और RRH048 (BayGenomics, CA) का उपयोग करके एक Specc1l की कमी वाला माउस मॉडल बनाया, जो इंट्रॉन 1 का प्रतिनिधित्व करता है और Specc1l प्रतिलेख 15 पर कैप्चर किए गए थे (चित्र 1) .4ए, चित्र एस2)।डिकॉय वेक्टर इंसर्ट का जीनोमिक स्थान संपूर्ण जीनोम अनुक्रमण द्वारा निर्धारित किया गया था और पीसीआर (छवि एस 2) द्वारा पुष्टि की गई थी।दोनों जीन ट्रैप डिज़ाइनों ने कैप्चर करने पर Specc11-lacZ रिपोर्टर्स के इन-फ़्रेम फ़्यूज़न की भी अनुमति दी।इसलिए, एक्स-गैल स्टेनिंग द्वारा निर्धारित लैक्ज़ अभिव्यक्ति का उपयोग Specc11 अभिव्यक्ति के संकेतक के रूप में किया गया था।दोनों एलील्स ने समान लैक्ज़ अभिव्यक्ति पैटर्न दिखाए, इंट्रॉन 1 में DTM096 जीन ट्रैप ने इंट्रॉन 15 में RRH048 की तुलना में अधिक मजबूत अभिव्यक्ति दिखाई (दिखाया नहीं गया)।हालाँकि, Specc1l को व्यापक रूप से व्यक्त किया गया है, E8.5 (चित्र 4B) पर तंत्रिका सिलवटों में, E9.5 और E10.5 (चित्र 4C,D) पर तंत्रिका ट्यूब और चेहरे की प्रक्रियाओं में, और विकासशील अंगों में विशेष रूप से मजबूत अभिव्यक्ति के साथ। E10 पर.5 और आंखें (चित्र 4डी)।हमने पहले बताया था कि E10.5 पर पहले ग्रसनी चाप में SPECC1L अभिव्यक्ति सीएनसीसी वंश के अनुरूप उपकला और अंतर्निहित मेसेनकाइम18 में मौजूद थी।सीएनसीसी में SPECC1L अभिव्यक्ति का परीक्षण करने के लिए, हमने E8.5 तंत्रिका सिलवटों (चित्र 4E-J) और E9.5 खोपड़ी अनुभाग (चित्र 4K-) का प्रदर्शन किया।E8.5 पर, SPECC1L ने तंत्रिका सिलवटों को तीव्रता से दाग दिया (चित्र 4E, H), जिसमें NCC मार्करों से रंगी कोशिकाएं भी शामिल हैं (चित्र 4G, J)।E9.5 पर, SPECC1L (चित्र 4K, N) मजबूती से दागदार माइग्रेटिंग CNCC AP2A (चित्र 4L, M) या SOX10 (चित्र 4O, P) के साथ सह-दागित है।
(ए) ईएस डीटीएम096 (इंट्रोन 1) और आरआरएच048 (इंट्रोन 15) सेल क्लोन में डिकॉय वेक्टर सम्मिलन दिखाते हुए माउस स्पेक11 जीन का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व।(बीडी) विषमयुग्मजी Specc1lDTM096 भ्रूणों का लैक्ज़ धुंधलापन E8.5 से E10.5 तक Specc1l अभिव्यक्ति का प्रतिनिधित्व करता है।एनई = न्यूरोएक्टोडर्म, एनएफ = न्यूरल फोल्ड, पीए1 = पहला ग्रसनी आर्क।(ईपी) ई8.5 (एनएफ; ईजे) तंत्रिका सिलवटों और ई9.5 (केपी) खोपड़ी वर्गों में एनसीसी मार्कर एपी2ए और एसओएक्स10 के साथ एसपीईसीसी1एल इम्यूनोस्टेनिंग।SPECC1L धुंधलापन व्यापक रूप से तंत्रिका सिलवटों E8.5 (E, H; एरोहेड्स) में देखा गया था, जिसमें AP2A (F, G; एरोहेड्स) और SOX10 (I, J; एरोहेड्स) लेबल वाली कोशिकाएं शामिल थीं।E9.5 पर, SPECC1L ने AP2A (L, M; तीर) और SOX10 (O, P; तीर) लेबल वाले माइग्रेटिंग CNCCs (K, N; तीर) को दृढ़ता से दाग दिया।
विषमयुग्मजी Specc1lDTM096/+ और Specc1lRRH048/+ चूहों के बीच क्रॉसिंग से पता चलता है कि दो जीन ट्रैप एलील पूरक नहीं हैं और किसी भी जीन ट्रैप एलील के लिए यौगिक हेटेरोज़ीगोट्स और भ्रूणीय होमोज़ाइट्स भ्रूण घातक हैं (तालिका S1)।मेंडेलियन अनुपात ने जन्म के समय हेटेरोजाइट्स की जीवित रहने की दर में कमी का संकेत दिया (अपेक्षित 1.34 बनाम 2.0)।हमने हेटेरोज़ायगोट्स के बीच कम प्रसवकालीन मृत्यु दर देखी, कुछ में क्रैनियोफेशियल विसंगतियाँ थीं (चित्र S3)।हालाँकि, इन पेरिनैटल क्रैनियोफेशियल फेनोटाइप्स की कम पैठ उनके अंतर्निहित पैथोफिजियोलॉजिकल तंत्र का अध्ययन करना मुश्किल बना देती है।इसलिए, हमने समयुग्मजी Specc11 म्यूटेंट के भ्रूणीय घातक फेनोटाइप पर ध्यान केंद्रित किया।
अधिकांश यौगिक विषमयुग्मजी या समयुग्मजी Specc1lDTM096/RRH048 उत्परिवर्ती भ्रूण E9.5-10.5 (चित्र 5A-D) के बाद विकसित नहीं हुए, और तंत्रिका ट्यूब पूर्वकाल में बंद नहीं हुई (चित्र 5B, D) और कभी-कभी पीछे से बंद हो जाती है (दिखाया नहीं गया) ..यह कपाल न्यूरल ट्यूब बंद होने का दोष अधिकांश सीएनसीसी चिह्नित डीएलएक्स2 के साथ जुड़ा था जो ई10.5 पर तंत्रिका सिलवटों में शेष था, जो कोई विच्छेदन नहीं होने का संकेत देता है (चित्र 5ए'-डी')।यह निर्धारित करने के लिए कि क्या CNCC का समग्र आकार भी कम हो गया था, हमने Wnt1-Cre और ROSAmTmG के साथ हमारे जीन ट्रैप लाइनों में GFP के साथ CNCC लाइनों को टैग किया।हम पूरे भ्रूण से क्रमबद्ध जीएफपी+ एनसीसी और जीएफपी- (आरएफपी+) गैर-एनसीसी स्ट्रीम करते हैं।E9.5 पर, प्रवाह-सॉर्ट किए गए GFP-लेबल सीएनसीसी का अनुपात डब्ल्यूटी और उत्परिवर्ती भ्रूणों के बीच महत्वपूर्ण रूप से नहीं बदला (दिखाया नहीं गया), जो सामान्य सीएनसीसी विनिर्देश को दर्शाता है।इसलिए, हमने अनुमान लगाया कि उजागर तंत्रिका सिलवटों में अवशिष्ट Wnt1-Cre और DLX2 धुंधलापन दोषपूर्ण CNCC लेयरिंग के कारण था, संभवतः AJ कोशिकाओं के बढ़े हुए घनत्व या फैलाव के कारण, जैसा कि SPECC1L-kd कोशिकाओं में देखा गया था।हमने तंत्रिका तह में सीएनसीसी की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए एनसीसी मार्कर SOX10, AP2A और DLX2 का उपयोग किया (चित्र 5E-R)।E8.5 पर, सभी तीन एनसीसी मार्करों के लिए तंत्रिका गुना धुंधलापन डब्ल्यूटी (छवि 5ई, जी, आई) और स्पेक1एल उत्परिवर्ती (छवि 5एफ, एच, जे) के अनुभागों में देखा गया था।E9.5 पर, जबकि NCC मार्करों ने WT अनुभागों (चित्र 5M, O, Q) में माइग्रेटिंग NCC को दाग दिया, Specc1l उत्परिवर्ती भ्रूण (चित्र 5N, P, R) के उजागर तंत्रिका सिलवटों में अवशिष्ट NCC धुंधलापन देखा गया।क्योंकि SOX10 और DLX2 सीएनसीसी को माइग्रेट करने को चिह्नित करते हैं, इस परिणाम से पता चलता है कि SPECC1L-कमी वाले सीएनसीसी माइग्रेटरी के बाद के विनिर्देश प्राप्त करते हैं लेकिन तंत्रिका सिलवटों से माइग्रेट करने में विफल रहते हैं।
Specc11 की कमी से दोषपूर्ण न्यूरल ट्यूब बंद हो जाती है, कपाल तंत्रिका शिखा कोशिकाओं और एजे का प्रदूषण होता है।
(ए, बी') ई9.5 डब्ल्यूटी (ए) प्रवासी कपाल तंत्रिका शिखा कोशिकाओं (सीएनसीसी) को ले जाने वाला भ्रूण, जिसे Wnt1-Cre (ए') के साथ लेबल किया गया है।इसके विपरीत, Specc11 उत्परिवर्ती भ्रूण खुले तंत्रिका सिलवटों (बी), एरोहेड्स) और सीएनसीसी दिखाते हैं जो माइग्रेट नहीं हुए हैं (बी', एरोहेड्स)।(सी, डी') ई10.5 डब्ल्यूटी भ्रूण (सी, सी') और स्पेक1एल (डी, डी') के सीएनसीसी मार्कर डीएलएक्स2 की उज्ज्वल क्षेत्र छवियां (सी, डी') और इम्यूनोस्टेनिंग (सी', डी')।डब्ल्यूटी ई10.5 भ्रूण में, डीएलएक्स2-पॉजिटिव सीएनसीसी गिल मेहराब (सी', तीर) को उपनिवेशित करता है, जबकि उत्परिवर्ती में, विशिष्ट धुंधलापन खुले तंत्रिका सिलवटों (डी', तीर) और पहले ग्रसनी मेहराब (डी') में बना रहता है। तीर).) कुछ धुंधलापन (तीर) के साथ सीएनसीसी के खराब प्रदूषण और माइग्रेशन का संकेत मिलता है।ईआर) चरणों E8.5 (E-L) और E9.5 (M-R) पर WT और Specc1l उत्परिवर्ती भ्रूणों के अनुभागों को NCC मार्कर SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H) के साथ लेबल किया गया था। ओ, पी ) और डीएलएक्स2 (आई, जे, क्यू, आर)।E8.5 पर, एनसीसी धुंधलापन जंगली-प्रकार के तंत्रिका गुना (एनएफ) और उत्परिवर्ती वर्गों में देखा गया था।E8.5 WT (K) और उत्परिवर्ती (L) में SOX10 और β-कैटेनिन के सह-धुंधला होने से तंत्रिका सिलवटों में कोशिका सीमाओं पर β-कैटेनिन धुंधलापन बढ़ गया।E9.5 पर, माइग्रेटिंग सीएनसीसी (एम, ओ, क्यू) का जंगली-प्रकार का धुंधलापन देखा गया, जबकि उत्परिवर्ती में, अस्थिर सीएनसीसी ने खुले तंत्रिका सिलवटों (एन, पी, आर) को दाग दिया।(एस-जेड) ई9.5 उत्परिवर्तन के साथ डब्ल्यूटी और स्पेक11डीटीएम096/आरआरएच048 भ्रूण के कोरोनल वर्गों में विवो एजे लेबलिंग विश्लेषण।ऊपरी दाएं कोने में एक अनुमानित अनुभागीय विमान दिखाया गया है।उत्परिवर्ती ऊतकों के वर्गों में, एफ-एक्टिन (एस, टी) और मायोसिन आईआईबी (यू, वी) का बढ़ा हुआ धुंधलापन देखा गया।चित्र 3 में इन विट्रो परिणामों के समान, उत्परिवर्ती भ्रूणों में, β-कैटेनिन (डब्ल्यू, एक्स) और ई-कैडरिन (वाई, जेड) के लिए बढ़ाया झिल्ली धुंधलापन देखा गया था।(एए-बीबी) एपिकल-बेसल सेल की सीमा से परे देखने वाले जंगली-प्रकार के भ्रूण के एक खंड का एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ चिपकने वाले जंक्शनों (एए, तीर) का संकेत देने वाला एक अलग इलेक्ट्रॉन-सघन क्षेत्र दिखाता है।इसके विपरीत, Specc11 उत्परिवर्ती भ्रूण (बीबी, तीर) के वर्गों में, संपूर्ण एपिकोबासल जंक्शन इलेक्ट्रॉन सघन है, जो चिपकने वाले जंक्शनों के बढ़े हुए घनत्व और फैलाव का संकेत देता है।
हमारी परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए कि परत में कमी परिवर्तित एजे के कारण है, हमने Specc1l उत्परिवर्ती भ्रूणों के उजागर तंत्रिका सिलवटों में एजे लेबलिंग की जांच की (चित्र 5एस-जेड)।हमने एक्टिन तनाव फाइबर (छवि 5 एस, टी) में वृद्धि देखी और एक्टिन फाइबर पर मायोसिन आईआईबी धुंधला के स्थानीयकरण में वृद्धि देखी (चित्र 5 यू, वी)।महत्वपूर्ण बात यह है कि हमने अंतरकोशिकीय सीमाओं पर β-कैटेनिन (चित्र 5W,X) और ई-कैडरिन (चित्र 5Y,Z) का बढ़ा हुआ धुंधलापन देखा।हमने E8.5 भ्रूण के तंत्रिका सिलवटों में एनसीसी के β-कैटेनिन धुंधलापन की भी जांच की (चित्र 5K, L)।Specc1l उत्परिवर्ती तंत्रिका सिलवटों (चित्र 5L और K) में β-कैटेनिन धुंधलापन अधिक मजबूत दिखाई दिया, जिससे पता चलता है कि AJ परिवर्तन शुरू हो गए थे।E9.5 भ्रूण के खोपड़ी वर्गों के इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ में, हमने फिर से WT (छवि 5AA, BB और S1E-H) की तुलना में Specc1l उत्परिवर्ती भ्रूण में बढ़े हुए इलेक्ट्रॉन-घने धुंधलापन को देखा।एक साथ लेने पर, ये परिणाम SPECC1L-kd U2OS कोशिकाओं में हमारे इन विट्रो परिणामों का समर्थन करते हैं और सुझाव देते हैं कि हमारे उत्परिवर्ती भ्रूणों में असामान्य AJ धुंधलापन CNCC स्तरीकरण से पहले होता है।
AKT गतिविधि और E-कैडरहिन स्थिरता के बीच ज्ञात विरोधी संबंध को देखते हुए,17,28 हमने PI3K-AKT सिग्नलिंग की भागीदारी की परिकल्पना की।इसके अलावा, हमने अपने कुछ उत्परिवर्ती भ्रूणों में सबएपिडर्मल ब्लिस्टरिंग देखी जो E9.5-10.5 पर घातकता (<5%) से बच गए और इसके बजाय E13.5 (छवि S3) के आसपास बस गए।सबएपिडर्मल वेसिकल्स PDGFRα12 पर आधारित कम PI3K-AKT सिग्नलिंग की पहचान हैं।फैंटौज़ो एट अल।(2014) ने बताया कि PdgfraPI3K/PI3K उत्परिवर्ती भ्रूणों में PDGFRα-आधारित PI3K सक्रियण के विघटन के परिणामस्वरूप सबएपिडर्मल वेसिकल्स, न्यूरल ट्यूब दोष और फांक तालु फेनोटाइप होते हैं।वास्तव में, Specc1l उत्परिवर्ती ऊतकों में पैन-AKT और सक्रिय फॉस्फोराइलेटेड Ser473-AKT का स्तर E9.5 भ्रूणीय गिरफ्तारी (चित्र 6A-D) तक कम हो गया था।फॉस्फोराइलेटेड Ser473-AKT के स्तर में कमी पूरी तरह से विवो (चित्र 6E) और इन विट्रो (चित्र 6F) में पैन-AKT के स्तर में कमी के कारण हो सकती है।इन विट्रो में कमी केवल तभी देखी गई जब U2OS कोशिकाएं कोशिका आकार और AJ घनत्व (चित्र 6D) में परिवर्तन के साथ दृढ़ता से मिली हुई थीं।इस प्रकार, हमारा डेटा बताता है कि SPECC1L क्रैनियोफेशियल मॉर्फोजेनेसिस में PI3K-AKT सिग्नलिंग का एक नया सकारात्मक नियामक है।
(ए-ई) ई8.5 (ए,बी) और ई9.5 (सी,डी) खोपड़ी अनुभाग या स्पेक1एल उत्परिवर्ती भ्रूण से ई9.5 लाइसेट्स (ई) सक्रिय फॉस्फोराइलेटेड एस473-एकेटी और पैन-एकेटी प्रोटीन कमी के स्तर को दर्शाता है। , डब्ल्यूटी को नियंत्रित करने की तुलना में।उन्हीं परिस्थितियों में जंगली प्रकार के लाइसेट्स और उत्परिवर्ती लाइसेट्स पर वेस्टर्न ब्लॉटिंग का प्रदर्शन किया गया।SPECC1L के लिए दिखाई गई छवियां एक ब्लॉट से ली गई थीं।उसी धब्बा को हटा दिया गया और एंटी-पैन-एसीटी और β-एक्टिन एंटीबॉडी के साथ फिर से जांच की गई।E8.5 तंत्रिका सिलवटों (ए, बी) में पैन-एकेटी स्तर और ई9.5 खोपड़ी वर्गों में फॉस्फोराइलेटेड एस473-एकेटी का स्तर काफी कम हो गया था।(एफ) उच्च संगम पर एकत्रित SPECC1L-kd U2OS कोशिकाओं के लाइसेट्स में पैन-एकेटी स्तर समान रूप से कम हो गया था।त्रुटि पट्टियाँ तीन स्वतंत्र पश्चिमी ब्लॉट मात्राओं से SEM का प्रतिनिधित्व करती हैं।(जीजे) ई9.5 पर डब्ल्यूटी भ्रूण के खंड क्रमशः केआई67 और क्लीव्ड कैस्पेज़ 3 से रंगे हुए हैं, जो कोशिका प्रसार (जी, जी') और थोड़ी एपोप्टोटिक गतिविधि (एच, एच') दिखा रहे हैं।Specc11 उत्परिवर्ती भ्रूण तुलनीय कोशिका प्रसार (I) दिखाते हैं, लेकिन एपोप्टोसिस से गुजरने वाली कोशिकाओं की संख्या में काफी वृद्धि हुई है (J)।
फिर हमने प्रसार और एपोप्टोसिस के मार्करों की जांच की।हमने E9.5 भ्रूण (I की तुलना में चित्र 6E, G) के प्रसार में कोई अंतर नहीं देखा, जिसमें WT म्यूटेंट के लिए 82.5% का प्रसार सूचकांक और KI67 स्टेनिंग (p <0.56, फिशर) द्वारा मापा गया Specc1l म्यूटेंट के लिए 86.5% था। सटीक परीक्षण).इसी तरह, हमने भ्रूण की गिरफ्तारी (दिखाया नहीं गया) (दिखाया नहीं गया) तक E8.5 पर तंत्रिका सिलवटों में क्लीवेड कैस्पेज़ 3 के लिए धुंधला द्वारा मापा गया एपोप्टोसिस में कोई अंतर नहीं देखा।इसके विपरीत, सभी E9.5 उत्परिवर्ती भ्रूणों में एपोप्टोसिस में उल्लेखनीय वृद्धि हुई थी (चित्र 6F, H और J)।एपोप्टोसिस में यह समग्र वृद्धि कम PI3K-AKT सिग्नलिंग और प्रारंभिक भ्रूण घातकता 29,30,31 के अनुरूप है।
इसके बाद, हमारे केडी कोशिकाओं में एजे परिवर्तनों में पीआई3के-एकेटी सिग्नलिंग के लिए एक कारण भूमिका की पुष्टि करने के लिए, हमने रासायनिक रूप से नियंत्रण और केडी कोशिकाओं में मार्ग को बदल दिया (चित्र 7ए-एफ)।हमने एक मार्कर के रूप में संगम SPECC1L-kd कोशिकाओं में देखे गए सेल आकार परिवर्तन फेनोटाइप का उपयोग किया, जिसे हमने संबंधित ऊर्ध्वाधर आयाम (चौड़ाई) के सबसे लंबे आयाम (लंबाई) के अनुपात का उपयोग करके निर्धारित किया।अपेक्षाकृत गोल या घनाकार कोशिकाओं के लिए 1 का अनुपात अपेक्षित है (चित्र 7जी)।कोशिका आकार के अलावा, हमने β-कैटेनिन स्टेनिंग (चित्र 7ए'-एफ') द्वारा एजे पर प्रभाव की भी पुष्टि की।वॉर्टमैनिन का उपयोग करके PI3K-AKT मार्ग का निषेध नियंत्रण कोशिकाओं (चित्र 7A,C) और AJ (चित्र 7A') में कोशिका आकार को बदलने के लिए पर्याप्त था।PI3K-AKT एक्टिवेटर SC-79 ने नियंत्रण कोशिकाओं में कोशिका आकार (चित्र 7A, E) या AJ विस्तार (चित्र 7A') को प्रभावित नहीं किया।SPECC1L-kd कोशिकाओं में, PI3K-AKT मार्ग के और दमन के परिणामस्वरूप एपोप्टोसिस में वृद्धि हुई (चित्र 7B,D) और β-कैटेनिन स्टेनिंग (चित्र 7B') में उल्लेखनीय वृद्धि हुई, जो हमारे इन विवो हेवी म्यूटेंट के अनुरूप है।महत्वपूर्ण रूप से, PI3K-AKT मार्ग के सक्रियण से कोशिका आकार (चित्र 7B,F) और AJ फेनोटाइप (चित्र 7B”) में काफी सुधार हुआ।कोशिका के आकार में परिवर्तन को कोशिका गोलाई अनुपात (सीसीआर) के रूप में निर्धारित किया गया था और ऊपर वर्णित अनुसार महत्व के लिए तुलना की गई थी (चित्र 7जी)।वास्तव में, नियंत्रण कोशिकाओं (चित्र 7जी, सीसीआर = 1.56) में, वॉर्टमैनिन उपचार कोशिका के आकार में उल्लेखनीय परिवर्तन करने के लिए पर्याप्त था (चित्र 7जी, सीसीआर = 3.61, पी <2.4 × 10-9) जैसा कि देखा गया था। SPECC1L में।-केडी कोशिकाएं (चित्र 7जी, सीसीआर = 3.46)।SPECC1L-kd कोशिकाओं (चित्र 7G, CCR = 3.60, नगण्य) का वोर्टमैनिन उपचार अनुपचारित kd कोशिकाओं (चित्र 7G, CCR = 3.46, नगण्य) या वोर्टमैनिन-उपचारित नियंत्रण कोशिकाओं (चित्र 7G) से अधिक महत्वपूर्ण नहीं था।, सीसीआर = 3.46, नगण्य) अतिरिक्त रूप से कोशिका बढ़ाव को प्रभावित करता है (7जी, सीसीआर = 3.61, नगण्य)।सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि SC-79 AKT एक्टिवेटर ने SPECC1L-kd कोशिकाओं के विस्तारित फेनोटाइप को बहाल किया (चित्र 7G, CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12)।ये परिणाम पुष्टि करते हैं कि SPECC1L PI3K-AKT सिग्नलिंग को नियंत्रित करता है और सुझाव देता है कि SPECC1L में मध्यम कमी कोशिका आसंजन को प्रभावित करती है, जबकि एक मजबूत कमी से एपोप्टोसिस होता है (चित्र 8)।
(ए-एफ') नियंत्रण (ए, सी, ई) और एसपीईसीसी1एल-केडी (बी, डी, एफ) कोशिकाओं का इलाज पीआई3के-एकेटी पाथवे इनहिबिटर वोर्टमैनिन (सी, डी) या एससी-79 एक्टिवेटर (ई, एफ) से किया जाता है। .अनुपचारित नियंत्रण कोशिकाएं सामान्य β-बिल्ली सेलुलर धुंधलापन (ए') के साथ घनाकार (ए) होती हैं, जबकि केडी कोशिकाएं बढ़ी हुई β-बिल्ली धुंधलापन (बी') के साथ लम्बी (बी) होती हैं।PI3K-AKT मार्ग के दमन के बाद, नियंत्रण कोशिकाएं β-कैट विस्तार (C') के साथ लम्बी (C) हो गईं, जबकि kd कोशिकाएं हमारे अत्यधिक उत्परिवर्तित भ्रूणों के समान एपोप्टोसिस (D) से गुजरना शुरू कर दीं और अत्यधिक उन्नत β-कैट दिखा रही थीं।धुंधला हो जाना (डी')।PI3K-AKT मार्ग के सक्रिय होने के बाद, नियंत्रण कोशिकाएं घनाकार (E) बनी रहीं और उनमें सामान्य β-कैट (E') धुंधलापन दिखाई दिया, जबकि kd कोशिकाओं ने कोशिका आकार (F) और β-बिल्ली (F') धुंधलापन में काफी सुधार दिखाया, जो दर्शाता है (जी) मेटामॉर्फ सॉफ्टवेयर का उपयोग करके सबसे लंबे आयाम (लंबाई) और संबंधित ऊर्ध्वाधर आयाम (चौड़ाई) के सेल गोलाकार अनुपात (सीसीआर) का उपयोग करके (एएफ) में सेल आकार परिवर्तन की डिग्री निर्धारित की गई थी।अनुपचारित (एनटी) एसपीईसीसी1एल-केडी कोशिकाएं (सीसीआर = 3.46) नियंत्रण कोशिकाओं (सीसीआर = 1.56, पी <6.1 × 10-13) की तुलना में काफी लंबी थीं।नियंत्रण कोशिकाओं में PI3K-AKT मार्ग का वॉर्ट का अवरोध कोशिका आकार में समान बढ़ाव पैदा करने के लिए पर्याप्त था (CCR=3.61, p<2.4×10-9)।इसी प्रकार, SPECC1L-kd कोशिकाओं में SC-79 द्वारा AKT सक्रियण ने सेल बढ़ाव को नियंत्रित स्तर (CCR = 1.74, p < 6.2 × 10–12) पर बहाल कर दिया।SPECC1L-kd कोशिकाओं के वॉर्टमैनिन उपचार के परिणामस्वरूप एपोप्टोसिस में वृद्धि हुई, लेकिन अनुपचारित केडी (CCR=3.46, ns) या वॉर्टमैनिन-उपचारित नियंत्रण कोशिकाओं (3.61) की तुलना में कोशिका आकार परिवर्तन (CCR=3.60) में कोई और वृद्धि नहीं देखी गई।एनएस = कोई फर्क नहीं पड़ता.+/- 50 कोशिकाओं के लिए SEM माप दिखाए गए हैं।छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके सांख्यिकीय अंतर की गणना की गई।
(ए) पीआई3के-एकेटी मार्ग के निषेध और सक्रियण का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व जिसके परिणामस्वरूप क्रमशः एजे परिवर्तन और बचाव होता है।(बी) SPECC1L द्वारा AKT प्रोटीन स्थिरीकरण के लिए प्रस्तावित मॉडल।
प्रीमिग्रेटरी सीएनसीसी को पूर्वकाल तंत्रिका गुना न्यूरोएपिथेलियल कोशिकाओं1,15,32 से अलग करने के लिए एजे लसीका की आवश्यकता होती है।एजे घटकों के बढ़ते धुंधलापन और इन विट्रो और विवो दोनों में SPECC1L की कमी वाली कोशिकाओं में एपिकल-बेसल AJ असममित वितरण का नुकसान, SPECC1L की β-कैटेनिन से भौतिक निकटता के साथ मिलकर, सुझाव देता है कि SPECC1L AJ स्थानीय स्थिरता को ठीक से बनाए रखने के लिए कार्य करता है। संगठन की मांसपेशियाँ।एक्टिन साइटोस्केलेटन।एसपीईसीसी1एल का एक्टिन साइटोस्केलेटन और β-कैटेनिन के साथ संबंध और एसपीईसीसी1एल की अनुपस्थिति में संघनित एक्टिन फिलामेंट्स की संख्या में वृद्धि एजे घनत्व में देखी गई वृद्धि के अनुरूप है।एक और संभावना यह है कि SPECC1L की कमी वाली कोशिकाओं में एक्टिन फाइबर की बढ़ी हुई संख्या अंतरकोशिकीय तनाव में बदलाव लाती है।क्योंकि सेलुलर तनाव एजे 33 की गतिशीलता को प्रभावित करता है, वोल्टेज परिवर्तन के परिणामस्वरूप एजे 34 अधिक फैल सकता है।इसलिए कोई भी परिवर्तन सीएनसीसी परतों को प्रभावित करेगा।
Wnt1 प्रारंभिक तंत्रिका परतों में व्यक्त होता है जो तंत्रिका शिखा कोशिकाओं को जन्म देता है।इस प्रकार, Wnt1-cre वंशावली अनुरेखण NCC35 से पहले और प्रवासन दोनों को चिह्नित करता है।हालाँकि, Wnt1 प्रारंभिक तंत्रिका सिलवटों 35,36 से प्राप्त पृष्ठीय मस्तिष्क ऊतक क्लोनों को भी चिह्नित करता है, जिससे यह संभावना बनती है कि खुले तंत्रिका सिलवटों में Wnt1 मार्करों के लिए E9.5 म्यूटेंट का हमारा धुंधलापन CNCC नहीं है।एनसीसी मार्कर AP2A और SOX10 के लिए हमारे सकारात्मक धुंधलापन ने पुष्टि की कि Specc11 उत्परिवर्ती भ्रूण के उजागर तंत्रिका सिलवटों में वास्तव में CNCC शामिल था।इसके अलावा, चूंकि AP2A और SOX10 प्रारंभिक माइग्रेटिंग एनसीसी के मार्कर हैं, सकारात्मक धुंधलापन ने संकेत दिया कि ये कोशिकाएं पोस्ट-माइग्रेटरी सीएनसीसी हैं जिन्हें E9.5 द्वारा स्तरीकृत नहीं किया जा सकता है।
हमारा डेटा सुझाव देता है कि SPECC1L द्वारा AJ का आणविक विनियमन PI3K-AKT सिग्नलिंग द्वारा मध्यस्थ होता है।SPECC1L की कमी वाली कोशिकाओं और ऊतकों में AKT सिग्नलिंग कम हो जाती है।फैंटौज़ो एट अल द्वारा निष्कर्ष।क्रैनियोफेशियल मॉर्फोजेनेसिस में PI3K-AKT सिग्नलिंग के लिए प्रत्यक्ष भूमिका का समर्थन करें।(2014) से पता चला कि PDGFRα-आधारित PI3K-AKT सिग्नलिंग की सक्रियता की कमी से फांक तालु फेनोटाइप होता है।हम यह भी दिखाते हैं कि PI3K-AKT मार्ग का अवरोध U2OS कोशिकाओं में AJ और कोशिका आकार को बदलने के लिए पर्याप्त है।हमारे निष्कर्षों के अनुरूप, कैन एट अल।37 से पता चला कि एंडोथेलियल कोशिकाओं में PI3K α110 सबयूनिट के डाउनरेगुलेशन के परिणामस्वरूप पेरीसेलुलर β-कैटेनिन धुंधलापन में समान वृद्धि होती है, जिसे "कनेक्टिविटी इंडेक्स" में वृद्धि के रूप में जाना जाता है।हालाँकि, एंडोथेलियल कोशिकाओं में जिनके एक्टिन फिलामेंट्स पहले से ही अत्यधिक व्यवस्थित हैं, PI3K-AKT मार्ग के दमन के परिणामस्वरूप एक ढीली कोशिका का आकार होता है।इसके विपरीत, SPECC1L-kd U2OS कोशिकाओं ने एक लम्बी कोशिका आकृति दिखाई।यह अंतर कोशिका प्रकार विशिष्ट हो सकता है।जबकि PI3K-AKT सिग्नलिंग का दमन स्थायी रूप से एक्टिन साइटोस्केलेटन को प्रभावित करता है, कोशिका आकार पर प्रभाव केंद्रीय एक्टिन फाइबर के घनत्व और संगठन में परिवर्तन के कारण तनाव में परिवर्तन से निर्धारित होता है।U2OS कोशिकाओं में, हमने SPECC1L-कमी वाले AJ परिवर्तन और पुनर्प्राप्ति के मार्कर के रूप में केवल कोशिका आकार परिवर्तन का उपयोग किया।निष्कर्ष में, हम परिकल्पना करते हैं कि SPECC1L की कमी में AKT मार्ग का अवरोध AJ स्थिरता को बढ़ाता है और CNCC में प्रदूषण को कम करता है।
दिलचस्प बात यह है कि SPECC1L की अनुपस्थिति में फॉस्फोराइलेटेड 473-AKT स्तरों के अलावा इन विट्रो और विवो में पैन-AKT का स्तर कम हो गया था, जो AKT प्रोटीन स्थिरता या टर्नओवर के स्तर पर PI3K-AKT सिग्नलिंग के विनियमन का सुझाव देता है।SPECC1L और MID1 जीन, दोनों Opitz/GBBB सिंड्रोम से जुड़े हैं, प्रोटीन को एनकोड करते हैं जो सूक्ष्मनलिकाएं 18,22 को स्थिर करते हैं।वह तंत्र जिसके द्वारा SPECC1L और MID1 सूक्ष्मनलिका स्थिरीकरण में मध्यस्थता करते हैं, पूरी तरह से समझा नहीं गया है।SPECC1L के मामले में, इस स्थिरीकरण में सूक्ष्मनलिकाएं 18 के एक उपसमूह का बढ़ाया एसिटिलीकरण शामिल है।यह संभव है कि SPECC1L AKT जैसे अन्य प्रोटीन को स्थिर करने के लिए एक समान तंत्र का उपयोग करता है।यह दिखाया गया है कि AKT प्रोटीन में लाइसिन अवशेषों के एसिटिलेशन से झिल्ली स्थानीयकरण और फॉस्फोराइलेशन38 में कमी आती है।इसके अलावा, AKT पर समान लाइसिन अवशेष पर K63 श्रृंखला का सर्वव्यापीकरण इसके झिल्ली स्थानीयकरण और सक्रियण39,40 के लिए आवश्यक है।विभिन्न उच्च थ्रूपुट यीस्ट दो-हाइब्रिड स्क्रीन में पहचाने गए SPECC1L प्रोटीन के साथ बातचीत करने वाले कई कारकों में से चार - CCDC841, ECM2942, APC और UBE2I43 - को सर्वव्यापकता या सम्मोहन के माध्यम से प्रोटीन टर्नओवर या स्थिरता में शामिल किया गया है।SPECC1L AKT लाइसिन अवशेषों के पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन में शामिल हो सकता है, जिससे AKT स्थिरता प्रभावित हो सकती है।हालाँकि, AKT प्रोटीन के स्थानीयकरण और स्थिरता में SPECC1L की महत्वपूर्ण भूमिका को स्पष्ट किया जाना बाकी है।
विवो में SPECC1L अभिव्यक्ति में गंभीर दोषों के परिणामस्वरूप AJ मार्कर धुंधलापन और दोषपूर्ण CNCC ओवरले में वृद्धि हुई, साथ ही एपोप्टोसिस और प्रारंभिक भ्रूण घातकता में वृद्धि हुई।पिछली रिपोर्टों से पता चला है कि एपोप्टोसिस के बढ़े हुए स्तर वाले माउस म्यूटेंट न्यूरल ट्यूब दोष 44,45,46,47 और क्रैनियोफेशियल दोष48 से जुड़े हैं।यह सुझाव दिया गया है कि तंत्रिका सिलवटों या ग्रसनी मेहराब में अत्यधिक कोशिका मृत्यु के परिणामस्वरूप उचित मॉर्फोजेनेटिक मूवमेंट 48,49,50 के लिए आवश्यक कोशिकाओं की अपर्याप्त संख्या हो सकती है।इसके विपरीत, हमारी SPECC1L की कमी वाली सेल लाइनों में मामूली रूप से कम SPECC1L अभिव्यक्ति के साथ कोशिका मृत्यु में वृद्धि के सबूत के बिना केवल AJ परिवर्तन दिखाई दिए।हालाँकि, इन केडी कोशिकाओं में PI3K-AKT मार्ग के रासायनिक अवरोध के परिणामस्वरूप एपोप्टोसिस में वृद्धि हुई।इस प्रकार, SPECC1L अभिव्यक्ति या फ़ंक्शन में मध्यम कमी कोशिका अस्तित्व सुनिश्चित करती है।यह इस अवलोकन के अनुरूप है कि दुर्लभ Specc11 उत्परिवर्ती भ्रूण जो सेंट में गिरफ्तारी से बच जाते हैं।E9.5-शायद कम जीन कैप्चर दक्षता के कारण-अपने तंत्रिका ट्यूबों को बंद करने और बाद में विकास को रोकने में सक्षम होते हैं, अक्सर क्रैनियोफेशियल दोषों के साथ (छवि एस3)।इसके अलावा क्रानियोफेशियल असामान्यताओं के साथ विषमयुग्मजी Specc1l भ्रूणों की दुर्लभ घटना भी इसके अनुरूप है - संभवतः जीन कैप्चर दक्षता में वृद्धि के कारण - साथ ही ज़ेब्राफिश में यह पाया गया है कि दो SPECC1L ऑर्थोलॉग्स (specc1lb) में से एक देर से भ्रूण के फेनोटाइप का कारण बनता है, जिसमें नुकसान भी शामिल है। निचले जबड़े और द्विपक्षीय फांक51.इस प्रकार, मानव रोगियों में पहचाने जाने वाले विषमयुग्मजी SPECC1L हानि-कार्य उत्परिवर्तन क्रैनियोफेशियल मॉर्फोजेनेसिस के दौरान SPECC1L फ़ंक्शन में छोटी हानि का कारण बन सकते हैं, जो उनके ओरोफेशियल फांक को समझाने के लिए पर्याप्त है।अंतरकोशिकीय संपर्कों का SPECC1L-आधारित विनियमन ग्रसनी मेहराब के तालुजनन और संलयन में भी भूमिका निभा सकता है।SPECC1L फ़ंक्शन के आगे के अध्ययन से न्यूरोएपिथेलियल सेल गतिशीलता और क्रानियोफेशियल मॉर्फोजेनेसिस में न्यूरल ट्यूब बंद होने के दौरान सीएनसीसी में अस्थायी अंतरकोशिकीय संपर्कों की भूमिका को स्पष्ट करने में मदद मिलेगी।
U2OS ओस्टियोसारकोमा नियंत्रण और SPECC1L-kd कोशिकाओं का वर्णन पहले किया जा चुका है (सादी एट अल., 2011)।SPECC1L के विरुद्ध एंटीबॉडी को पहले भी चिह्नित किया गया है (सादी एट अल., 2011)।एंटी-बीटा-कैटेनिन एंटीबॉडीज (खरगोश; 1:1000; सांता क्रूज़, डलास, टेक्सास) (माउस; 1:1000; सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी, डेनवर, एमए), मायोसिन आईआईबी (1:1000; सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस) ) , एमओ) ), ई-कैडरिन (1:1000; अबकम, कैम्ब्रिज, एमए), एपी2ए (1:1000; नोवस बायोलॉजिकल, लिटलटन, कोलो.), एसओएक्स10 (1:1000; 1000; अवीवा सिस्टम्स बायोलॉजी, सैन डिएगो , कैलिफोर्निया), DLX2 (1:1000; Abcam, कैम्ब्रिज, MA), फॉस्फो-Ser473-AKT (1:1000; सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी, डेनवर, MA), पैन-AKT (1:1000; थर्मोफिशर साइंटिफिक, वाल्थम, MA ) , KI67 (1:1000; सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी, डेनवर, एमए), क्लीव्ड कैस्पेज़ 3 (1:1000; सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी, डेनवर, एमए) और β-एक्टिन (1:2500; सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, MO ) का उपयोग वर्णित अनुसार किया गया था।.एक्टिन फिलामेंट्स को एक्टी-स्टेन रोडामाइन फालोइडिन (साइटोस्केलेटन, डेनवर, कोलोराडो) से रंगा गया था।
U2OS नियंत्रण कोशिकाओं और SPECC1L-kd कोशिकाओं को 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (लाइफ टेक्नोलॉजीज, कार्ल्सबैड, सीए) के साथ पूरक मानक उच्च ग्लूकोज DMEM में संवर्धित किया गया था।एजे परिवर्तनों के लिए, 2 x 105 कोशिकाओं को 0.1% पोर्सिन जिलेटिन (सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ) से उपचारित ग्लास पर रखा गया और कोशिका के आकार में परिवर्तन के लिए देखा गया।कोशिकाओं को अलग-अलग संकेतित समय बिंदुओं पर एकत्र किया गया था: बीज बोने के 4 घंटे बाद (t = 1), बीज बोने के 24 घंटे बाद (t = 2), कोशिका आकार में परिवर्तन के बिना संगम (t = 3), कोशिका आकार में परिवर्तन (t = 4) , कोशिका आकार बदलने के 24 घंटे बाद (t = 5) और कोशिका आकार बदलने के 48 घंटे बाद (t = 6) (चित्र 1, 2, 3)।PI3K-AKT मार्ग को व्यवस्थित करने के लिए, कोशिकाओं को PI3K-AKT अवरोधक वॉर्टमैनिन (TOCRIS बायोसाइंसेज, मिनियापोलिस, मिनेसोटा) या SC-79 एक्टिवेटर (TOCRIS बायोसाइंसेज, मिनियापोलिस एडम्स, मिनेसोटा) के साथ संकेतित सांद्रता में संवर्धित किया गया था।रसायन युक्त माध्यम प्रतिदिन बदला जाता था।
सामान्य संस्कृति स्थितियों के तहत लाइव नियंत्रण और केडी कोशिकाओं पर फ़्रेम-दर-फ़्रेम रिकॉर्डिंग की गई, और 7 दिनों के लिए हर 10 मिनट में चरण कंट्रास्ट छवियां एकत्र की गईं।छवियां एक कंप्यूटर-नियंत्रित लीका डीएम आईआरबी उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्राप्त की गईं जो एक यांत्रिक चरण और एक क्यूइमेजिंग रेटिगा-एसआरवी कैमरे से जुड़े 10 × एन-पीएलएएन उद्देश्य से सुसज्जित है।इमेजिंग के दौरान, सेल कल्चर को 5% CO2 के साथ आर्द्र वातावरण में 37°C पर बनाए रखा गया।
क्षेत्रीय उत्परिवर्ती माउस संसाधन केंद्र (यूसी डेविस, सीए) से दो जीन ट्रैप ES सेल लाइनों DTM096 और RRH048 का उपयोग Specc11 की कमी वाली माउस लाइनों, निर्दिष्ट Specc1lgtDTM096 और Specc1lgtRRH046 को उत्पन्न करने के लिए किया गया था।संक्षेप में, 129/आरईजे ईएस कोशिकाओं को C57BL6 ब्लास्टोसिस्ट में इंजेक्ट किया गया था।परिणामी काइमेरिक नर चूहों को एगौटी कोट रंगाई वाली संतानों की पहचान करने के लिए मादा C57BL6 चूहों के साथ प्रजनन कराया गया।हेटेरोज़ायगोट्स की पहचान करने के लिए जीन ट्रैप वेक्टर आवेषण की उपस्थिति का उपयोग किया गया था।चूहों को 129/आरईजे;सी57बीएल6 की मिश्रित पृष्ठभूमि पर रखा गया था।आनुवंशिक ट्रैप वेक्टर के सम्मिलन स्थल के स्थान की पुष्टि आरटी-पीसीआर, जीनोम अनुक्रमण और आनुवंशिक पूरकता (पूरक चित्र 1) द्वारा की गई थी।दोहरे विषमयुग्मजी Specc1lGT चूहों के CNCC वंश का पता लगाने के लिए, ROSAmTmG (#007576) और Wnt1-Cre (#003829) चूहों (जैक्सन प्रयोगशाला, बार हार्बर, ME) को Specc1l उत्परिवर्ती भ्रूणों में ROSAmTmG और Wnt1-Cre एलील का उत्पादन करने के लिए पार किया गया था।चूहों पर सभी प्रयोग कैनसस मेडिकल सेंटर विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार किए गए थे।
भ्रूण को कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए (1% फॉर्मेल्डिहाइड, 0.2% ग्लूटाराल्डिहाइड, 2 मिमी MgCl2, 0.02% NP-40, 5 मिमी EGTA) में स्थिर किया गया था।एक्स-गैल स्टेनिंग सॉल्यूशन (5 एमएम पोटेशियम फेरिकैनाइड, 5 एमएम पोटेशियम फेरोसाइनाइड, 2 एमएम एमजीसीएल2, 0.01% सोडियम डीऑक्सीकोलेट, 0.02% एनपी-40, 1 मिलीग्राम/एमएल एक्स-गैल) में निर्धारण के बाद दाग का विकास 37 डिग्री सेल्सियस पर किया गया था। .1-6 घंटे के भीतर डिग्री सेल्सियस।भ्रूणों को 4% पीएफए ​​में पोस्ट-फिक्स किया गया और विज़ुअलाइज़ किया गया।
वेस्टर्न ब्लॉटिंग के लिए, कोशिकाओं को एचएएलटी प्रोटीज़ इनहिबिटर (सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ) के मिश्रण के साथ पूरक निष्क्रिय लिसीस बफर (पेमरेगा, फिचबर्ग, डब्ल्यूआई) में लाइस किया गया था।लाइसेट्स को 12% पॉलीएक्रिलामाइड मिनी-प्रोटीन टीजीएक्स तैयार जैल (बायो-रेड, हरक्यूलिस, सीए) पर संसाधित किया गया और इमोबिलॉन पीवीडीएफ झिल्ली (ईएमडी मिलिपोर, बिलेरिका, एमए) में स्थानांतरित किया गया।पीबीएस में 0.1% ट्वीन युक्त 5% दूध में झिल्ली अवरुद्ध हो गई थी।एंटीबॉडीज़ को रात भर 4°C पर या एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट किया गया।फेम्टो सुपरसिग्नल वेस्ट ईसीएल अभिकर्मक (थर्मो साइंटिफिक, वाल्थम, एमए) का उपयोग सिग्नल उत्पादन के लिए किया गया था।इम्यूनोस्टेनिंग के लिए, भ्रूणों को रात भर 4% पीएफए/पीबीएस में रखा गया और क्रायोप्रिजर्व किया गया।ऊतक क्रायोसेक्शन को पीबीएस में 1% सामान्य बकरी सीरम (थर्मो साइंटिफिक, वाल्थम, एमए) और 0.1% ट्राइटन एक्स-100 (सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ) से अवरुद्ध किया गया था और फिर इनक्यूबेटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया था। रात।4°C पर 1 घंटे के लिए एंटी-एंटीबॉडी और फ्लोरोसेंट सेकेंडरी एंटीबॉडी (1:1000) के साथ।दाग वाले खंडों को प्रोलॉन्ग गोल्ड मीडियम (थर्मो साइंटिफिक, वाल्थम एमए) में रखा गया था और लीका टीसीएस एसपीई कन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके सपाट छवियां प्राप्त की गईं थीं।प्रत्येक इम्यूनोस्टेनिंग को कम से कम दो उत्परिवर्ती भ्रूणों के सिरोसेक्शन पर तीन स्वतंत्र प्रयोगों के रूप में किया गया था।प्रतिनिधि प्रयोग दिखाया गया है।
कोशिकाओं को संशोधित आरआईपीए बफर (20 मिमी ट्रिस-एचसीएल, पीएच 8.0, 1% एनपी -40, 130 मिमी NaCl, 10% ग्लिसरॉल, 2 मिमी ईडीटीए, और एचएएलटी प्रोटीज अवरोधक (सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ) में ऊष्मायन किया गया था। संक्षेप में, लाइसेट्स को प्रोटीन जी चुंबकीय मोतियों (लाइफ टेक्नोलॉजीज, कार्ल्सबैड, सीए) के साथ पहले से शुद्ध किया गया था और फिर रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया था। एंटी-एसपीईसीसी1एल या आईजीजी प्रोटीन के साथ जी प्रोटीन मोतियों का इस्तेमाल एसपीईसीसी1एल निकालने के लिए किया गया था और वेस्टर्न ब्लॉटिंग को एंटी-एसपीईसीसी1एल का उपयोग करके किया गया था। -बीटा-कैटेनिन एंटीबॉडी ऊपर वर्णित है। दिखाए गए सह-आईपी प्रयोग चार स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं।
कैनसस मेडिकल सेंटर विश्वविद्यालय के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी केंद्र को स्थिर संवर्धित कोशिकाएं या माउस भ्रूण ऊतक प्रदान किए गए थे।संक्षेप में, नमूनों को ईएमबेड 812 रेजिन (इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी साइंसेज, फोर्ट वाशिंगटन, पीए) में एम्बेड किया गया था, 60 डिग्री सेल्सियस पर रात भर पॉलिमराइज़ किया गया था, और हीरे के ब्लेड से सुसज्जित लीका यूसी7 अल्ट्रामाइक्रोटोम का उपयोग करके 80 एनएम पर खंडित किया गया था।100 केवी लैब6 गन से सुसज्जित जेईओएल जेईएम-1400 ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके अनुभागों की कल्पना की गई थी।
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