304 स्टेनलेस स्टील कॉइल ट्यूबिंग रासायनिक घटक, एसपीएसीए6 एक्टोडोमेन की संरचना में गैमीट संलयन से जुड़े प्रोटीन का एक संरक्षित सुपरफैमिली होता है।

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SPACA6 एक शुक्राणु-व्यक्त सतह प्रोटीन है जो स्तनधारी यौन प्रजनन के दौरान युग्मक संलयन के लिए महत्वपूर्ण है।इस मौलिक भूमिका के बावजूद, SPACA6 के विशिष्ट कार्य को कम समझा गया है।हम 2.2 Å के रिज़ॉल्यूशन पर SPACA6 के बाह्य कोशिकीय डोमेन की क्रिस्टल संरचना को स्पष्ट करते हैं, जो चार-फंसे बंडल और अर्ध-लचीले लिंकर्स से जुड़े आईजी-जैसे β-सैंडविच से बना दो-डोमेन प्रोटीन का खुलासा करता है।यह संरचना IZUMO1 से मिलती-जुलती है, जो एक अन्य युग्मक संलयन-संबंधित प्रोटीन है, जो SPACA6 और IZUMO1 को निषेचन-संबंधित प्रोटीन के सुपरफैमिली के संस्थापक सदस्य बनाता है, जिन्हें यहां IST सुपरफैमिली के रूप में संदर्भित किया गया है।आईएसटी सुपरफैमिली को संरचनात्मक रूप से इसके मुड़े हुए चार-हेलिक्स बंडल और डाइसल्फ़ाइड-लिंक्ड सीएक्सएक्ससी रूपांकनों की एक जोड़ी द्वारा परिभाषित किया गया है।मानव प्रोटीओम की संरचना-आधारित अल्फाफोल्ड खोज ने इस सुपरफैमिली के अतिरिक्त प्रोटीन सदस्यों की पहचान की;विशेष रूप से, इनमें से कई प्रोटीन युग्मक संलयन में शामिल होते हैं।SPACA6 संरचना और IST सुपरफैमिली के अन्य सदस्यों के साथ इसका संबंध स्तनधारी युग्मक संलयन के हमारे ज्ञान में लापता लिंक प्रदान करता है।
प्रत्येक मानव जीवन की शुरुआत दो अलग-अलग अगुणित युग्मकों से होती है: पिता का शुक्राणु और माँ का अंडाणु।यह शुक्राणु एक गहन चयन प्रक्रिया का विजेता है जिसके दौरान लाखों शुक्राणु कोशिकाएं महिला जननांग पथ से गुजरती हैं, विभिन्न बाधाओं को पार करती हैं1 और कैपेसिटेशन से गुजरती हैं, जो उनकी गतिशीलता और सतह घटकों2,3,4 की प्रक्रिया को बढ़ाती है।भले ही शुक्राणु और अंडाणु एक-दूसरे को पा लें, प्रक्रिया अभी खत्म नहीं हुई है।अंडाणु क्यूम्यलस कोशिकाओं की एक परत और ज़ोना पेलुसीडा नामक एक ग्लाइकोप्रोटीन अवरोध से घिरा होता है, जिसके माध्यम से शुक्राणु को अंडाणु में प्रवेश करने के लिए गुजरना पड़ता है।शुक्राणु इन अंतिम बाधाओं को दूर करने के लिए सतह आसंजन अणुओं और झिल्ली से जुड़े और स्रावित एंजाइमों के संयोजन का उपयोग करते हैं।ये अणु और एंजाइम मुख्य रूप से आंतरिक झिल्ली और एक्रोसोमल मैट्रिक्स में संग्रहित होते हैं और इनका पता तब चलता है जब एक्रोसोमल प्रतिक्रिया के दौरान शुक्राणु की बाहरी झिल्ली नष्ट हो जाती है।इस गहन यात्रा का अंतिम चरण शुक्राणु-अंडा संलयन घटना है, जिसमें दो कोशिकाएं अपनी झिल्लियों को मिलाकर एक एकल द्विगुणित जीव बन जाती हैं7।यद्यपि यह प्रक्रिया मानव प्रजनन में अभूतपूर्व है, आवश्यक आणविक अंतःक्रियाओं को कम समझा जाता है।
युग्मकों के निषेचन के अलावा, दो लिपिड बाइलेयर्स के संलयन के रसायन विज्ञान का बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है।सामान्य तौर पर, झिल्ली संलयन एक ऊर्जावान रूप से प्रतिकूल प्रक्रिया है जिसके लिए प्रोटीन उत्प्रेरक को संरचनात्मक संरचना परिवर्तन से गुजरना पड़ता है जो दो झिल्ली को एक साथ लाता है, उनकी निरंतरता को तोड़ता है और संलयन 8,9 का कारण बनता है।इन प्रोटीन उत्प्रेरकों को फ्यूसोजेन के रूप में जाना जाता है और ये अनगिनत संलयन प्रणालियों में पाए गए हैं।वे मेजबान कोशिकाओं में वायरल प्रवेश के लिए आवश्यक हैं (उदाहरण के लिए, एचआईवी -1 में जीपी 160, कोरोनवायरस में स्पाइक, इन्फ्लूएंजा वायरस में हेमाग्लगुटिनिन) 10,11,12 प्लेसेंटल (सिंसिटिन) 13,14,15 और निचले यूकेरियोट्स में युग्मक-गठन संलयन ( पौधों, प्रोटिस्टों और आर्थ्रोपोड्स में HAP2/GCS1) 16,17,18,19।मानव युग्मकों के लिए फ्यूसोजेन की अभी तक खोज नहीं की गई है, हालांकि कई प्रोटीनों को युग्मक के जुड़ाव और संलयन के लिए महत्वपूर्ण दिखाया गया है।oocyte-व्यक्त CD9, माउस और मानव युग्मकों के संलयन के लिए आवश्यक एक ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन, 21,22,23 में खोजा जाने वाला पहला था।यद्यपि इसका सटीक कार्य अस्पष्ट है, आसंजन में भूमिका, अंडे के माइक्रोविली पर आसंजन फॉसी की संरचना, और/या ओओसाइट सतह प्रोटीन का सही स्थानीयकरण 24,25,26 होने की संभावना है।दो सबसे विशिष्ट प्रोटीन जो युग्मक संलयन के लिए महत्वपूर्ण हैं, वे हैं शुक्राणु प्रोटीन IZUMO127 और oocyte प्रोटीन JUNO28, और उनका पारस्परिक जुड़ाव संलयन से पहले युग्मक पहचान और आसंजन में एक महत्वपूर्ण कदम है।नर इज़ुमो1 नॉकआउट चूहे और मादा जूनो नॉकआउट चूहे पूरी तरह से बाँझ होते हैं, इन मॉडलों में शुक्राणु पेरिविटेलिन स्पेस में प्रवेश करते हैं लेकिन युग्मक आपस में जुड़ते नहीं हैं।इसी प्रकार, जब मानव इन विट्रो निषेचन प्रयोगों में युग्मकों को एंटी-IZUMO1 या JUNO27,29 एंटीबॉडी के साथ इलाज किया गया तो संगम कम हो गया था।
हाल ही में, IZUMO1 और JUNO20,30,31,32,33,34,35 के समान फेनोटाइपिक रूप से शुक्राणु-व्यक्त प्रोटीन के एक नए खोजे गए समूह की खोज की गई है।बड़े पैमाने पर म्यूरिन उत्परिवर्तन अध्ययन में शुक्राणु एक्रोसोमल झिल्ली से जुड़े प्रोटीन 6 (एसपीएसीए 6) को निषेचन के लिए आवश्यक के रूप में पहचाना गया है।स्पाका 6 जीन में ट्रांसजीन के सम्मिलन से गैर-फ्यूजिबल शुक्राणु पैदा होते हैं, हालांकि ये शुक्राणु पेरिविटेलिन स्पेस 36 में घुसपैठ करते हैं।चूहों में बाद के नॉकआउट अध्ययनों से पुष्टि हुई कि गैमीट संलयन 30,32 के लिए Spaca6 आवश्यक है।SPACA6 को लगभग विशेष रूप से वृषण में व्यक्त किया जाता है और इसका स्थानीयकरण पैटर्न IZUMO1 के समान होता है, अर्थात् एक्रोसोमल प्रतिक्रिया से पहले शुक्राणु के इंटिमा के भीतर, और फिर एक्रोसोमल प्रतिक्रिया 30,32 के बाद भूमध्यरेखीय क्षेत्र में स्थानांतरित हो जाता है।Spaca6 होमोलॉग विभिन्न प्रकार के स्तनधारियों और अन्य यूकेरियोट्स 30 में मौजूद हैं और मानव युग्मक संलयन के लिए इसके महत्व को SPACA6 30 के प्रतिरोध द्वारा इन विट्रो में मानव निषेचन के निषेध द्वारा प्रदर्शित किया गया है।IZUMO1 और JUNO के विपरीत, SPACA6 की संरचना, अंतःक्रिया और कार्य का विवरण अस्पष्ट है।
मानव शुक्राणु और अंडों के संलयन की अंतर्निहित मूलभूत प्रक्रिया को बेहतर ढंग से समझने के लिए, जो हमें परिवार नियोजन और प्रजनन उपचार में भविष्य के विकास के बारे में सूचित करने में सक्षम बनाएगी, हमने SPACA6 संरचनात्मक और जैव रासायनिक अध्ययन किए।SPACA6 के बाह्य कोशिकीय डोमेन की क्रिस्टल संरचना एक चार-पेचदार बंडल (4HB) और एक इम्युनोग्लोबुलिन-जैसा (Ig-जैसा) डोमेन दिखाती है जो अर्ध-लचीले क्षेत्रों से जुड़ा हुआ है।जैसा कि पिछले अध्ययनों में अनुमान लगाया गया था, 7,32,37 SPACA6 की डोमेन संरचना मानव IZUMO1 के समान है, और दो प्रोटीन एक असामान्य रूपांकनों को साझा करते हैं: त्रिकोणीय पेचदार सतह के साथ 4HB और डाइसल्फ़ाइड-लिंक्ड CXXC रूपांकनों की एक जोड़ी।हमारा प्रस्ताव है कि IZUMO1 और SPACA6 अब युग्मक संलयन से जुड़े प्रोटीन के एक बड़े, संरचनात्मक रूप से संबंधित सुपरफैमिली को परिभाषित करते हैं।सुपरफैमिली के लिए अद्वितीय विशेषताओं का उपयोग करते हुए, हमने अल्फाफोल्ड संरचनात्मक मानव प्रोटिओम के लिए एक विस्तृत खोज की, इस सुपरफैमिली के अतिरिक्त सदस्यों की पहचान की, जिसमें युग्मक संलयन और/या निषेचन में शामिल कई सदस्य शामिल थे।अब ऐसा प्रतीत होता है कि युग्मक संलयन से जुड़े प्रोटीनों का एक सामान्य संरचनात्मक तह और सुपरफैमिली है, और हमारी संरचना मानव युग्मक संलयन तंत्र के इस महत्वपूर्ण पहलू का एक आणविक मानचित्र प्रदान करती है।
SPACA6 एक एकल-पास ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन है जिसमें एक एन-लिंक्ड ग्लाइकेन और छह पुटेटिव डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड (आंकड़े S1a और S2) हैं।हमने ड्रोसोफिला एस2 कोशिकाओं में मानव एसपीएसीए6 (अवशेष 27-246) के बाह्य कोशिकीय डोमेन को व्यक्त किया और निकल आत्मीयता, धनायन विनिमय और आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (छवि एस1बी) का उपयोग करके प्रोटीन को शुद्ध किया।शुद्ध SPACA6 एक्टोडोमैन बहुत स्थिर और सजातीय है।बहुभुज प्रकाश प्रकीर्णन (एसईसी-एमएएलएस) के साथ संयुक्त आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके विश्लेषण से 26.2 ± 0.5 केडीए (छवि एस 1 सी) की गणना आणविक भार के साथ एक शिखर का पता चला।यह SPACA6 मोनोमेरिक एक्टोडोमैन के आकार के अनुरूप है, जो दर्शाता है कि शुद्धिकरण के दौरान ऑलिगोमेराइजेशन नहीं हुआ।इसके अलावा, सर्कुलर डाइक्रोइज्म (सीडी) स्पेक्ट्रोस्कोपी ने 51.3 डिग्री सेल्सियस (छवि एस 1 डी, ई) के पिघलने बिंदु के साथ एक मिश्रित α/β संरचना का खुलासा किया।सीडी स्पेक्ट्रा के डीकोनवोल्यूशन से 38.6% α-हेलिकल और 15.8% β-स्ट्रैंडेड तत्व (चित्रा S1d) का पता चला।
SPACA6 एक्टोडोमेन को यादृच्छिक मैट्रिक्स सीडिंग38 का उपयोग करके क्रिस्टलीकृत किया गया था जिसके परिणामस्वरूप 2.2 Å (तालिका 1 और चित्र S3) के रिज़ॉल्यूशन वाला डेटा सेट प्राप्त हुआ।संरचना निर्धारण (तालिका 1 और चित्रा एस 4) के लिए ब्रोमाइड एक्सपोजर के साथ टुकड़े-आधारित आणविक प्रतिस्थापन और एसएडी चरणबद्ध डेटा के संयोजन का उपयोग करते हुए, अंतिम परिष्कृत मॉडल में अवशेष 27-246 होते हैं।जिस समय संरचना निर्धारित की गई थी, उस समय कोई प्रायोगिक या अल्फाफोल्ड संरचनाएं उपलब्ध नहीं थीं।SPACA6 एक्टोडोमेन का माप 20 Å × 20 Å × 85 Å है, इसमें सात हेलिकॉप्टर और नौ β-स्ट्रैंड होते हैं, और इसमें छह डाइसल्फ़ाइड बांड (छवि 1 ए, बी) द्वारा स्थिर एक लम्बी तृतीयक तह होती है।Asn243 साइड चेन के अंत में कमजोर इलेक्ट्रॉन घनत्व इंगित करता है कि यह अवशेष एक एन-लिंक्ड ग्लाइकोसिलेशन है।संरचना में दो डोमेन होते हैं: एक एन-टर्मिनल चार-हेलिक्स बंडल (4HB) और एक सी-टर्मिनल आईजी-जैसा डोमेन, जिनके बीच एक मध्यवर्ती काज क्षेत्र होता है (छवि 1 सी)।
SPACA6 के बाह्यकोशिकीय डोमेन की संरचना।SPACA6 के बाह्यकोशिकीय डोमेन का स्ट्रिप आरेख, N से C-टर्मिनस तक श्रृंखला का रंग गहरे नीले से गहरे लाल तक।डाइसल्फ़ाइड बांड में शामिल सिस्टीन को मैजेंटा में हाइलाइट किया जाता है।b SPACA6 के बाह्यकोशिकीय डोमेन की टोपोलॉजी।चित्र 1ए के समान रंग योजना का उपयोग करें।c SPACA6 बाह्यकोशिकीय डोमेन।4HB, हिंज और Ig-जैसे डोमेन स्ट्रिप चार्ट क्रमशः नारंगी, हरे और नीले रंग में हैं।परतें पैमाने पर नहीं खींची गई हैं।
SPACA6 के 4HB डोमेन में चार मुख्य हेलिकॉप्टर (हेलीकॉप्टर 1-4) शामिल हैं, जो एक हेलिकल हेलिक्स (छवि 2 ए) के रूप में व्यवस्थित होते हैं, जो एंटीपैरलल और समानांतर इंटरैक्शन (छवि 2 बी) के बीच बारी-बारी से होते हैं।एक छोटा अतिरिक्त सिंगल-टर्न हेलिक्स (हेलिक्स 1') बंडल के लंबवत रखा गया है, जो हेलिकॉप्टर 1 और 2 के साथ एक त्रिकोण बनाता है। यह त्रिकोण हेलिकॉप्टर 3 और 4 की अपेक्षाकृत घनी पैकिंग के हेलिकल-मुड़ पैकिंग में थोड़ा विकृत है। चित्र 2ए)।
4HB एन-टर्मिनल स्ट्रिप चार्ट।बी चार हेलिकॉप्टरों के एक बंडल का शीर्ष दृश्य, प्रत्येक हेलिक्स एन-टर्मिनस पर गहरे नीले रंग में और सी-टर्मिनस पर गहरे लाल रंग में हाइलाइट किया गया है।सी 4एचबी के लिए टॉप-डाउन सर्पिल व्हील आरेख, प्रत्येक अवशेष को एकल-अक्षर अमीनो एसिड कोड के साथ लेबल किए गए सर्कल के रूप में दिखाया गया है;पहिये के शीर्ष पर केवल चार अमीनो एसिड क्रमांकित हैं।गैर-ध्रुवीय अवशेष पीले रंग के होते हैं, ध्रुवीय अपरिवर्तित अवशेष हरे रंग के होते हैं, सकारात्मक चार्ज वाले अवशेष नीले रंग के होते हैं, और नकारात्मक चार्ज वाले अवशेष लाल रंग के होते हैं।d 4HB डोमेन के त्रिकोणीय फलक, नारंगी रंग में 4HB और हरे रंग में टिका है।दोनों इनसेट रॉड के आकार के डाइसल्फ़ाइड बांड दिखाते हैं।
4HB एक आंतरिक हाइड्रोफोबिक कोर पर केंद्रित है जो मुख्य रूप से स्निग्ध और सुगंधित अवशेषों से बना है (चित्र 2c)।कोर में Cys41 और Cys55 के बीच एक डाइसल्फ़ाइड बंधन होता है जो हेलिकॉप्टर 1 और 2 को एक ऊपरी उभरे हुए त्रिकोण में एक साथ जोड़ता है (चित्र 2d)।हेलिक्स 1′ में CXXC मोटिफ और हिंज क्षेत्र में β-हेयरपिन की नोक पर पाए जाने वाले एक अन्य CXXC मोटिफ के बीच दो अतिरिक्त डाइसल्फ़ाइड बांड बनाए गए थे (चित्र 2d)।एक अज्ञात फ़ंक्शन (Arg37) के साथ एक रूढ़िवादी आर्गिनिन अवशेष हेलिकॉप्टर 1', 1, और 2 द्वारा गठित खोखले त्रिकोण के अंदर स्थित है। एलिफैटिक कार्बन परमाणु Cβ, Cγ, और Cδ Arg37 हाइड्रोफोबिक कोर के साथ बातचीत करते हैं, और इसके गुआनिडाइन समूह चक्रीय रूप से चलते हैं थ्र32 बैकबोन और साइड चेन (छवि S5a, बी) के बीच बातचीत के माध्यम से हेलिकॉप्टर 1 'और 1 के बीच।Tyr34 दो छोटे छिद्रों को छोड़कर गुहा में फैलता है जिसके माध्यम से Arg37 विलायक के साथ बातचीत कर सकता है।
आईजी-जैसे β-सैंडविच डोमेन प्रोटीन का एक बड़ा सुपरफैमिली है जो हाइड्रोफोबिक कोर 39 के माध्यम से बातचीत करने वाले दो या दो से अधिक मल्टी-स्ट्रैंडेड एम्फीपैथिक β-शीट्स की सामान्य विशेषता साझा करता है। SPACA6 के सी-टर्मिनल आईजी-जैसे डोमेन का पैटर्न समान है और इसमें दो परतें होती हैं (चित्र S6a)।शीट 1 चार स्ट्रैंड्स (स्ट्रैंड्स डी, एफ, एच, और आई) की एक β-शीट है, जहां स्ट्रैंड्स एफ, एच, और आई एक एंटी-समानांतर व्यवस्था बनाते हैं, और स्ट्रैंड्स I और D एक समानांतर इंटरैक्शन करते हैं।तालिका 2 एक छोटी एंटी-समानांतर डबल-स्ट्रैंडेड बीटा शीट (स्ट्रैंड ई और जी) है।E श्रृंखला के C-टर्मिनस और H श्रृंखला के केंद्र (Cys170-Cys226) (चित्र S6b) के बीच एक आंतरिक डाइसल्फ़ाइड बंधन देखा गया।यह डाइसल्फ़ाइड बंधन इम्युनोग्लोबुलिन40,41 के β-सैंडविच डोमेन में डाइसल्फ़ाइड बंधन के अनुरूप है।
चार-स्ट्रैंड β-शीट अपनी पूरी लंबाई के साथ मुड़ती है, जिससे असममित किनारे बनते हैं जो आकार और इलेक्ट्रोस्टैटिक्स में भिन्न होते हैं।पतला किनारा एक सपाट हाइड्रोफोबिक पर्यावरणीय सतह है जो SPACA6 (चित्र S6b,c) में शेष असमान और इलेक्ट्रोस्टैटिक रूप से विविध सतहों की तुलना में अलग दिखता है।उजागर बैकबोन कार्बोनिल/अमीनो समूहों और ध्रुवीय पार्श्व श्रृंखलाओं का एक प्रभामंडल हाइड्रोफोबिक सतह को घेरता है (चित्र S6c)।व्यापक मार्जिन एक कैप्ड हेलिकल सेगमेंट द्वारा कवर किया गया है जो हाइड्रोफोबिक कोर के एन-टर्मिनल हिस्से को अवरुद्ध करता है और एफ चेन बैकबोन (छवि एस 6 डी) के खुले ध्रुवीय समूह के साथ तीन हाइड्रोजन बांड बनाता है।इस किनारे का सी-टर्मिनल भाग आंशिक रूप से उजागर हाइड्रोफोबिक कोर के साथ एक बड़ी जेब बनाता है।पॉकेट डबल आर्गिनिन अवशेषों (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 और Arg212-Arg214) और एक केंद्रीय हिस्टिडीन (His220) (चित्रा S6e) के तीन सेटों के कारण सकारात्मक चार्ज से घिरा हुआ है।
हिंज क्षेत्र हेलिकल डोमेन और आईजी-जैसे डोमेन के बीच एक छोटा खंड है, जिसमें एक एंटीपैरलल तीन-स्ट्रैंडेड β-लेयर (स्ट्रैंड ए, बी और सी), एक छोटा 310 हेलिक्स और कई लंबे यादृच्छिक हेलिकल खंड शामिल हैं।(चित्र S7)।हिंज क्षेत्र में सहसंयोजक और इलेक्ट्रोस्टैटिक संपर्कों का एक नेटवर्क 4HB और आईजी-जैसे डोमेन के बीच अभिविन्यास को स्थिर करता प्रतीत होता है।नेटवर्क को तीन भागों में विभाजित किया जा सकता है।पहले भाग में दो CXXC रूपांकनों (27CXXC30 और 139CXXC142) शामिल हैं जो काज में β-हेयरपिन और 4HB में 1′ हेलिक्स के बीच डाइसल्फ़ाइड बांड की एक जोड़ी बनाते हैं।दूसरे भाग में आईजी-जैसे डोमेन और हिंज के बीच इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन शामिल हैं।हिंज में ग्लू132 आईजी-जैसे डोमेन में Arg233 और हिंज में Arg135 के साथ एक नमक पुल बनाता है।तीसरे भाग में आईजी-जैसे डोमेन और हिंज क्षेत्र के बीच एक सहसंयोजक बंधन शामिल है।दो डाइसल्फ़ाइड बांड (Cys124-Cys147 और Cys128-Cys153) हिंज लूप को एक लिंकर से जोड़ते हैं जो Gln131 और बैकबोन कार्यात्मक समूह के बीच इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन द्वारा स्थिर होता है, जो पहले आईजी-जैसे डोमेन तक पहुंच की अनुमति देता है।जंजीर।
SPACA6 एक्टोडोमेन की संरचना और 4HB और Ig-जैसे डोमेन की व्यक्तिगत संरचनाओं का उपयोग प्रोटीन डेटाबेस 42 में संरचनात्मक रूप से समान रिकॉर्ड की खोज के लिए किया गया था।हमने उच्च डाली जेड स्कोर, छोटे मानक विचलन और बड़े एलएएलआई स्कोर (बाद वाले संरचनात्मक रूप से समकक्ष अवशेषों की संख्या) के साथ मैचों की पहचान की।जबकि पूर्ण एक्टोडोमेन खोज (तालिका एस1) से पहले 10 हिट्स का स्वीकार्य ज़ेड-स्कोर >842 था, अकेले 4एचबी या आईजी-जैसे डोमेन की खोज से पता चला कि इनमें से अधिकांश हिट केवल β-सैंडविच के अनुरूप थे।अनेक प्रोटीनों में पाया जाने वाला एक सर्वव्यापी तह।डाली में सभी तीन खोजों से केवल एक ही परिणाम आया: IZUMO1।
लंबे समय से यह सुझाव दिया गया है कि SPACA6 और IZUMO1 में संरचनात्मक समानताएं7,32,37 हैं।हालाँकि इन दो युग्मक संलयन-संबंधी प्रोटीनों के एक्टोडोमेन केवल 21% अनुक्रम पहचान (चित्रा S8a) साझा करते हैं, एक संरक्षित डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड पैटर्न और SPACA6 में एक अनुमानित सी-टर्मिनल आईजी-जैसे डोमेन सहित जटिल सबूत, एक निर्माण के शुरुआती प्रयासों की अनुमति देते हैं। टेम्पलेट37 के रूप में IZUMO1 का उपयोग करते हुए A SPACA6 माउस का होमोलॉजी मॉडल।हमारी संरचना इन भविष्यवाणियों की पुष्टि करती है और समानता की वास्तविक डिग्री दिखाती है।वास्तव में, SPACA6 और IZUMO137,43,44 संरचनाएं समान दो-डोमेन आर्किटेक्चर (छवि S8b) को समान 4HB और Ig-जैसे β-सैंडविच डोमेन के साथ एक काज क्षेत्र (छवि S8c) से जुड़ी हुई हैं।
IZUMO1 और SPACA6 4HB में पारंपरिक सर्पिल बंडलों से समान अंतर हैं।विशिष्ट 4HB, जैसे कि एंडोसोमल संलयन 45,46 में शामिल SNARE प्रोटीन कॉम्प्लेक्स में पाए जाते हैं, में केंद्रीय अक्ष 47 के चारों ओर निरंतर वक्रता बनाए रखने वाले समान दूरी वाले हेलिकॉप्टर होते हैं। इसके विपरीत, IZUMO1 और SPACA6 दोनों में पेचदार डोमेन परिवर्तनशील वक्रता के साथ विकृत थे और असमान पैकिंग (चित्र S8d)।मोड़, संभवतः हेलिकॉप्टर 1', 1 और 2 द्वारा निर्मित त्रिकोण के कारण होता है, IZUMO1 और SPACA6 में बरकरार रखा जाता है और हेलिक्स 1' पर समान CXXC मोटिफ द्वारा स्थिर किया जाता है।हालाँकि, SPACA6 में पाया गया अतिरिक्त डाइसल्फ़ाइड बंधन (Cys41 और Cys55 ऊपर हेलिकॉप्टर 1 और 2 को सहसंयोजक रूप से जोड़ता है) त्रिकोण शीर्ष पर एक तेज शीर्ष बनाता है, जिससे SPACA6 IZUMO1 की तुलना में अधिक मुड़ जाता है, और अधिक स्पष्ट गुहा त्रिकोण के साथ।इसके अलावा, IZUMO1 में SPACA6 में इस गुहा के केंद्र में Arg37 का अभाव देखा गया है।इसके विपरीत, IZUMO1 में स्निग्ध और सुगंधित अवशेषों का अधिक विशिष्ट हाइड्रोफोबिक कोर है।
IZUMO1 में एक आईजी-जैसा डोमेन है जिसमें डबल-स्ट्रैंडेड और पांच-स्ट्रैंडेड β-शीट43 शामिल है।IZUMO1 में अतिरिक्त स्ट्रैंड SPACA6 में कॉइल की जगह लेता है, जो स्ट्रैंड में बैकबोन हाइड्रोजन बॉन्ड को सीमित करने के लिए F स्ट्रैंड के साथ इंटरैक्ट करता है।तुलना का एक दिलचस्प बिंदु दो प्रोटीनों के आईजी-जैसे डोमेन का अनुमानित सतह चार्ज है।IZUMO1 सतह SPACA6 सतह की तुलना में अधिक नकारात्मक रूप से चार्ज होती है।एक अतिरिक्त चार्ज शुक्राणु झिल्ली के सामने सी-टर्मिनस के पास स्थित होता है।SPACA6 में, समान क्षेत्र अधिक तटस्थ या धनात्मक रूप से आवेशित थे (चित्र S8e)।उदाहरण के लिए, SPACA6 में हाइड्रोफोबिक सतह (पतले किनारे) और सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए गड्ढे (चौड़े किनारे) IZUMO1 में नकारात्मक रूप से चार्ज किए जाते हैं।
यद्यपि IZUMO1 और SPACA6 के बीच संबंध और द्वितीयक संरचना तत्व अच्छी तरह से संरक्षित हैं, आईजी-जैसे डोमेन के संरचनात्मक संरेखण से पता चला है कि दोनों डोमेन एक दूसरे के सापेक्ष अपने सामान्य अभिविन्यास में भिन्न हैं (छवि S9)।IZUMO1 का सर्पिल बंडल β-सैंडविच के बारे में घुमावदार है, जो केंद्रीय अक्ष से लगभग 50° पर पहले वर्णित "बूमरैंग" आकार बनाता है।इसके विपरीत, SPACA6 में हेलिकल बीम विपरीत दिशा में लगभग 10° झुका हुआ था।इन झुकावों में अंतर संभवतः काज क्षेत्र में अंतर के कारण है।प्राथमिक अनुक्रम स्तर पर, IZUMO1 और SPACA6 सिस्टीन, ग्लाइसिन और एसपारटिक एसिड अवशेषों के अपवाद के साथ, काज पर बहुत कम अनुक्रम समानता साझा करते हैं।परिणामस्वरूप, हाइड्रोजन बांड और इलेक्ट्रोस्टैटिक नेटवर्क पूरी तरह से अलग हैं।β-शीट माध्यमिक संरचना तत्व IZUMO1 और SPACA6 द्वारा साझा किए जाते हैं, हालांकि IZUMO1 में श्रृंखलाएं बहुत लंबी हैं और 310 हेलिक्स (हेलिक्स 5) SPACA6 के लिए अद्वितीय है।इन अंतरों के परिणामस्वरूप दो अन्यथा समान प्रोटीनों के लिए अलग-अलग डोमेन अभिविन्यास होते हैं।
हमारी डाली सर्वर खोज से पता चला कि SPACA6 और IZUMO1 प्रोटीन डेटाबेस में संग्रहीत केवल दो प्रयोगात्मक रूप से निर्धारित संरचनाएं हैं जिनमें यह विशेष 4HB फोल्ड (तालिका S1) है।अभी हाल ही में, डीपमाइंड (अल्फाबेट/गूगल) ने अल्फाफोल्ड विकसित किया है, जो एक तंत्रिका नेटवर्क आधारित प्रणाली है जो प्राथमिक अनुक्रमों48 से प्रोटीन की 3डी संरचनाओं की सटीक भविष्यवाणी कर सकती है।SPACA6 संरचना को हल करने के कुछ ही समय बाद, अल्फाफोल्ड डेटाबेस जारी किया गया, जो मानव प्रोटीओम में सभी प्रोटीनों के 98.5% को कवर करने वाले पूर्वानुमानित संरचना मॉडल प्रदान करता है।एक खोज मॉडल के रूप में हमारी हल की गई SPACA6 संरचना का उपयोग करते हुए, अल्फाफोल्ड मानव प्रोटिओम में मॉडल के लिए एक संरचनात्मक होमोलॉजी खोज ने SPACA6 और IZUMO1 के संभावित संरचनात्मक समानता वाले उम्मीदवारों की पहचान की।SPACA6 (छवि S10a) की भविष्यवाणी करने में अल्फाफोल्ड की अविश्वसनीय सटीकता को देखते हुए - विशेष रूप से हमारी हल की गई संरचना (छवि S10b) की तुलना में 1.1 Å rms एक्टोडोमेन - हम आश्वस्त हो सकते हैं कि पहचाने गए SPACA6 मिलान सटीक होने की संभावना है।
इससे पहले, PSI-BLAST ने तीन अन्य शुक्राणु-संबंधित प्रोटीनों के साथ IZUMO1 क्लस्टर की खोज की थी: IZUMO2, IZUMO3, और IZUMO450।अल्फाफोल्ड ने भविष्यवाणी की है कि ये IZUMO परिवार प्रोटीन IZUMO1 (आंकड़े 3 ए और एस 11) के समान डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड पैटर्न के साथ 4HB डोमेन में बदल जाते हैं, हालांकि उनमें आईजी-जैसे डोमेन का अभाव है।यह अनुमान लगाया गया है कि IZUMO2 और IZUMO3 IZUMO1 के समान एक तरफा झिल्ली प्रोटीन हैं, जबकि IZUMO4 स्रावित होता प्रतीत होता है।युग्मक संलयन में IZUMO 2, 3, और 4 प्रोटीन के कार्य निर्धारित नहीं किए गए हैं।IZUMO3 को शुक्राणु विकास51 के दौरान एक्रोसोम बायोजेनेसिस में भूमिका निभाने के लिए जाना जाता है और IZUMO प्रोटीन को एक कॉम्प्लेक्स50 बनाने के लिए पाया गया है।स्तनधारियों, सरीसृपों और उभयचरों में IZUMO प्रोटीन के संरक्षण से पता चलता है कि उनका संभावित कार्य अन्य ज्ञात युग्मक-संलयन-संबंधित प्रोटीन, जैसे DCST1/2, SOF1 और FIMP के अनुरूप है।
आईएसटी सुपरफैमिली के डोमेन आर्किटेक्चर का आरेख, क्रमशः 4HB, हिंज और Ig-जैसे डोमेन को नारंगी, हरे और नीले रंग में हाइलाइट किया गया है।IZUMO4 में एक अनोखा सी-टर्मिनल क्षेत्र है जो काला दिखता है।पुष्टिकृत और अनुमानित डाइसल्फ़ाइड बांड क्रमशः ठोस और बिंदीदार रेखाओं द्वारा दिखाए जाते हैं।b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (अल्फाफोल्ड DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (अल्फाफोल्ड DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (अल्फाफोल्ड DB: AF-Q1ZYL8-F1), और TMEM95 (अल्फाफोल्ड) DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) पैनल ए के समान रंग रेंज में प्रदर्शित होते हैं। डाइसल्फ़ाइड बांड मैजेंटा में दिखाए जाते हैं।TMEM95, IZUMO2 और IZUMO3 ट्रांसमेम्ब्रेन हेलिकॉप्टर नहीं दिखाए गए हैं।
IZUMO प्रोटीन के विपरीत, अन्य SPACA प्रोटीन (यानी, SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5, और SPACA9) को SPACA6 (चित्र S12) से संरचनात्मक रूप से भिन्न माना जाता है।केवल SPACA9 में 4HB है, लेकिन इसमें SPACA6 के समान समानांतर-विरोधी-समानांतर अभिविन्यास या समान डाइसल्फ़ाइड बंधन होने की उम्मीद नहीं है।केवल SPACA1 में समान Ig-समान डोमेन है।अल्फाफोल्ड का अनुमान है कि SPACA3, SPACA4 और SPACA5 की संरचना SPACA6 से बिल्कुल अलग है।दिलचस्प बात यह है कि SPACA4 को निषेचन में भूमिका निभाने के लिए भी जाना जाता है, लेकिन SPACA6 की तुलना में अधिक हद तक, यह शुक्राणु और oocyte zona pellucida52 के बीच बातचीत को सुविधाजनक बनाता है।
हमारी अल्फाफोल्ड खोज में IZUMO1 और SPACA6 4HB, TMEM95 के लिए एक और मिलान मिला।TMEM95, एक एकल शुक्राणु-विशिष्ट ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन, 32,33 को अलग करने पर नर चूहों को बांझ बना देता है।TMEM95 की कमी वाले शुक्राणु में सामान्य आकारिकी, गतिशीलता और ज़ोना पेलुसिडा में प्रवेश करने और अंडे की झिल्ली से जुड़ने की क्षमता थी, लेकिन अंडाणु झिल्ली के साथ विलय नहीं हो सका।पिछले अध्ययनों से पता चला है कि TMEM95 IZUMO133 के साथ संरचनात्मक समानताएं साझा करता है।दरअसल, अल्फाफोल्ड मॉडल ने पुष्टि की है कि TMEM95 एक 4HB है जिसमें IZUMO1 और SPACA6 के समान CXXC रूपांकनों की जोड़ी है और SPACA6 (चित्र 3a और S11) में पाए गए हेलिकॉप्टर 1 और 2 के बीच समान अतिरिक्त डाइसल्फ़ाइड बंधन है।हालाँकि TMEM95 में Ig-जैसे डोमेन का अभाव है, लेकिन इसमें SPACA6 और IZUMO1 हिंज क्षेत्रों (छवि 3 बी) के समान डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड पैटर्न वाला एक क्षेत्र है।इस पांडुलिपि के प्रकाशन के समय, प्रीप्रिंट सर्वर ने अल्फाफोल्ड53 परिणाम की पुष्टि करते हुए TMEM95 की संरचना की सूचना दी।TMEM95 SPACA6 और IZUMO1 के समान है और उभयचरों में पहले से ही विकसित रूप से संरक्षित है (चित्र 4 और S13)।
पीएसआई-ब्लास्ट खोज ने जीवन के वृक्ष में इन अनुक्रमों की स्थिति निर्धारित करने के लिए एनसीबीआई SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP और SOF1 डेटाबेस का उपयोग किया।शाखा बिंदुओं के बीच की दूरियों को पैमाने पर नहीं दिखाया गया है।
SPACA6 और IZUMO1 के बीच आश्चर्यजनक समग्र संरचनात्मक समानता से पता चलता है कि वे एक संरक्षित संरचनात्मक सुपरफैमिली के संस्थापक सदस्य हैं जिसमें TMEM95 और IZUMO 2, 3 और 4 प्रोटीन शामिल हैं।ज्ञात सदस्य: IZUMO1, SPACA6 और TMEM95।क्योंकि केवल कुछ सदस्यों के पास आईजी-जैसे डोमेन होते हैं, आईएसटी सुपरफैमिली की पहचान 4HB डोमेन है, जिसमें इन सभी प्रोटीनों के लिए सामान्य अद्वितीय विशेषताएं हैं: 1) एक एंटी-समानांतर/समानांतर विकल्प में व्यवस्थित हेलिकॉप्टरों के साथ कुंडलित 4HB (चित्र) . 5ए), 2) बंडल में एक त्रिकोणीय चेहरा होता है जिसमें बंडल के भीतर दो हेलिकॉप्टर होते हैं और एक तीसरा ऊर्ध्वाधर हेलिक्स होता है (चित्र मुख्य क्षेत्र (चित्र 5सी)। थिओरेडॉक्सिन जैसे प्रोटीन में पाए जाने वाले सीएक्सएक्ससी मोटिफ को कार्य करने के लिए जाना जाता है। रेडॉक्स सेंसर 54,55,56 के रूप में, जबकि आईएसटी परिवार के सदस्यों में मोटिफ गैमीट फ्यूजन में ईआरपी57 जैसे प्रोटीन डाइसल्फ़ाइड आइसोमेरेज़ से जुड़ा हो सकता है। भूमिकाएँ 57,58 से जुड़ी हैं।
आईएसटी सुपरफैमिली के सदस्यों को 4HB डोमेन की तीन विशिष्ट विशेषताओं द्वारा परिभाषित किया गया है: समानांतर और एंटीपैरलल अभिविन्यास, बा-त्रिकोणीय हेलिकल बंडल चेहरे, और छोटे अणुओं के बीच गठित एक सीए CXXC डबल मोटिफ के बीच वैकल्पिक चार हेलिकॉप्टर।) एन-टर्मिनल हेलिक्स (नारंगी) और काज क्षेत्र β-हेयरपिन (हरा)।
SPACA6 और IZUMO1 के बीच समानता को देखते हुए, SPACA6 और IZUMO1 या JUNO से जुड़ने की क्षमता का परीक्षण किया गया।बायोलेयर इंटरफेरोमेट्री (बीएलआई) एक गतिज-आधारित बाइंडिंग विधि है जिसका उपयोग पहले IZUMO1 और जूनो के बीच बातचीत को मापने के लिए किया गया है।JUNO विश्लेषण की उच्च सांद्रता के साथ चारे के रूप में IZUMO1 के साथ बायोटिन-लेबल सेंसर के ऊष्मायन के बाद, एक मजबूत संकेत का पता चला (छवि S14a), जो सेंसर टिप से जुड़े बायोमटेरियल की मोटाई में एक बाध्यकारी-प्रेरित परिवर्तन का संकेत देता है।समान सिग्नल (यानी, जूनो को IZUMO1 विश्लेषण के खिलाफ एक चारा के रूप में सेंसर से जोड़ा गया) (चित्र। S14b)।जब SPACA6 को सेंसर-बाउंड IZUMO1 या सेंसर-बाउंड JUNO (चित्र S14a,b) के विरुद्ध एक विश्लेषण के रूप में उपयोग किया गया तो कोई सिग्नल नहीं पाया गया।इस सिग्नल की अनुपस्थिति इंगित करती है कि SPACA6 का बाह्यकोशिकीय डोमेन IZUMO1 या JUNO के बाह्यकोशिकीय डोमेन के साथ इंटरैक्ट नहीं करता है।
क्योंकि बीएलआई परख चारा प्रोटीन पर मुक्त लाइसिन अवशेषों के बायोटिनाइलेशन पर आधारित है, यदि लाइसिन अवशेष बातचीत में शामिल होते हैं तो यह संशोधन बंधन को रोक सकता है।इसके अलावा, सेंसर के सापेक्ष बाइंडिंग का उन्मुखीकरण स्टेरिक बाधाएं पैदा कर सकता है, इसलिए पुनः संयोजक SPACA6, IZUMO1 और जूनो एक्टोडोमेन पर पारंपरिक पुल-डाउन परीक्षण भी किए गए।इसके बावजूद, SPACA6 ने उनके-टैग किए गए IZUMO1 या उनके-टैग किए गए JUNO (चित्र। S14c,d) के साथ अवक्षेपण नहीं किया, जो कि BLI प्रयोगों में देखी गई कोई बातचीत के अनुरूप नहीं है।एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, हमने उसके IZUMO1 (आंकड़े S14e और S15) लेबल के साथ जूनो की बातचीत की पुष्टि की।
SPACA6 और IZUMO1 के बीच संरचनात्मक समानता के बावजूद, JUNO को बांधने में SPACA6 की असमर्थता आश्चर्य की बात नहीं है।मानव IZUMO1 की सतह पर 20 से अधिक अवशेष हैं जो जूनो के साथ बातचीत करते हैं, जिसमें तीन क्षेत्रों में से प्रत्येक के अवशेष शामिल हैं (हालांकि उनमें से अधिकांश काज क्षेत्र में स्थित हैं) (छवि S14f)।इन अवशेषों में से केवल एक SPACA6 (Glu70) में संरक्षित है।जबकि कई अवशेष प्रतिस्थापनों ने अपने मूल जैव रासायनिक गुणों को बरकरार रखा, IZUMO1 में आवश्यक Arg160 अवशेषों को SPACA6 में नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए Asp148 द्वारा प्रतिस्थापित किया गया;पिछले अध्ययनों से पता चला है कि IZUMO1 में Arg160Glu उत्परिवर्तन JUNO43 से बंधन को लगभग पूरी तरह से समाप्त कर देता है।इसके अलावा, IZUMO1 और SPACA6 के बीच डोमेन ओरिएंटेशन में अंतर ने SPACA6 (छवि S14g) पर समतुल्य क्षेत्र के जूनो-बाइंडिंग साइट के सतह क्षेत्र में काफी वृद्धि की।
युग्मक संलयन के लिए SPACA6 की ज्ञात आवश्यकता और IZUMO1 से इसकी समानता के बावजूद, SPACA6 में समकक्ष जूनो बाइंडिंग फ़ंक्शन नहीं दिखता है।इसलिए, हमने अपने संरचनात्मक डेटा को विकासवादी जीव विज्ञान द्वारा प्रदान किए गए महत्व के साक्ष्य के साथ संयोजित करने का प्रयास किया है।SPACA6 समरूपों का अनुक्रम संरेखण स्तनधारियों से परे सामान्य संरचना के संरक्षण को दर्शाता है।उदाहरण के लिए, सिस्टीन अवशेष दूर से संबंधित उभयचरों में भी मौजूद होते हैं (चित्र 6ए)।कॉनसर्फ़ सर्वर का उपयोग करके, 66 अनुक्रमों के एकाधिक अनुक्रम संरेखण प्रतिधारण डेटा को SPACA6 सतह पर मैप किया गया था।इस प्रकार का विश्लेषण यह दिखा सकता है कि प्रोटीन विकास के दौरान कौन से अवशेष संरक्षित किए गए हैं और यह संकेत दे सकता है कि कौन से सतह क्षेत्र कार्य में भूमिका निभाते हैं।
क्लस्टल ओमेगा का उपयोग करके तैयार 12 विभिन्न प्रजातियों से SPACA6 एक्टोडोमेन का अनुक्रम संरेखण।कॉनसर्फ़ विश्लेषण के अनुसार, सबसे रूढ़िवादी पदों को नीले रंग में चिह्नित किया गया है।सिस्टीन अवशेषों को लाल रंग में हाइलाइट किया गया है।डोमेन सीमाएँ और द्वितीयक संरचना तत्व संरेखण के शीर्ष पर दिखाए जाते हैं, जहाँ तीर β-स्ट्रैंड्स को इंगित करते हैं और तरंगें हेलिकॉप्टरों को इंगित करती हैं।अनुक्रमों वाले एनसीबीआई एक्सेस पहचानकर्ता हैं: मानव (होमो सेपियंस, एनपी_001303901), मैंड्रिल (मैंड्रिलस ल्यूकोफियस, एक्सपी_011821277), कैपुचिन बंदर (सेबस मिमिक, एक्सपी_017359366), घोड़ा (इक्वस कैबेलस, एक्सपी_023506102), किलर व्हेल (ऑर्सिनस ओर्का3_23 एक्सपी_032 _034) .), भेड़ (ओविस एरीज़, XP_014955560), हाथी (लोक्सोडोंटा अफ़्रीकाना, XP_010585293), कुत्ता (कैनिस ल्यूपस फ़ैमिलिस, XP_025277208), चूहा (मस मस्कुलस, NP_001156381), तस्मानियाई शैतान (सरकोफिलस हैरिसी, XP_03611, XP_0318), प्लैटिपस , 8) , 61_89 और बुलफ्रॉग (बुफो बुफो, XP_040282113)।क्रमांकन मानव क्रम पर आधारित है।b शीर्ष पर 4HB और नीचे Ig-जैसे डोमेन के साथ SPACA6 संरचना का सतही प्रतिनिधित्व, ConSurf सर्वर से संरक्षण अनुमानों के आधार पर रंग।सबसे अच्छे संरक्षित हिस्से नीले रंग में हैं, मध्यम रूप से संरक्षित हिस्से सफेद रंग में हैं, और सबसे कम संरक्षित हिस्से पीले रंग में हैं।बैंगनी सिस्टीन.उच्च स्तर की सुरक्षा प्रदर्शित करने वाले तीन सतह पैच इनसेट लेबल वाले पैच 1, 2 और 3 में दिखाए गए हैं। शीर्ष दाईं ओर इनसेट में एक 4HB कार्टून दिखाया गया है (समान रंग योजना)।
SPACA6 संरचना में तीन अत्यधिक संरक्षित सतह क्षेत्र हैं (चित्र 6बी)।पैच 1 4HB और हिंज क्षेत्र तक फैला है और इसमें दो संरक्षित CXXC डाइसल्फ़ाइड ब्रिज, एक Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 हिंज नेटवर्क (चित्र S7), और तीन संरक्षित बाहरी सुगंधित अवशेष (Phe31, Tyr73, Phe137) शामिल हैं।आईजी-जैसे डोमेन का एक व्यापक रिम (चित्र। S6e), जो शुक्राणु सतह पर कई सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए अवशेषों का प्रतिनिधित्व करता है।दिलचस्प बात यह है कि इस पैच में एक एंटीबॉडी एपिटोप है जिसे पहले SPACA6 30 फ़ंक्शन में हस्तक्षेप करते हुए दिखाया गया है।क्षेत्र 3 आईजी-जैसे डोमेन के काज और एक तरफ तक फैला है;इस क्षेत्र में संरक्षित प्रोलाइन (प्रो126, प्रो127, प्रो150, प्रो154) और बाहर की ओर ध्रुवीय/आवेशित अवशेष शामिल हैं।आश्चर्यजनक रूप से, 4HB की सतह पर अधिकांश अवशेष अत्यधिक परिवर्तनशील हैं (चित्र 6 बी), हालांकि तह SPACA6 होमोलॉग में (जैसा कि हाइड्रोफोबिक बंडल कोर के रूढ़िवाद से संकेत मिलता है) और आईएसटी सुपरफैमिली से परे संरक्षित है।
यद्यपि यह SPACA6 में सबसे कम पता लगाने योग्य माध्यमिक संरचना तत्वों के साथ सबसे छोटा क्षेत्र है, कई काज क्षेत्र के अवशेष (क्षेत्र 3 सहित) SPACA6 होमोलॉग के बीच अत्यधिक संरक्षित हैं, जो संकेत दे सकता है कि हेलिकल बंडल और β-सैंडविच का अभिविन्यास एक भूमिका निभाता है।एक रूढ़िवादी के रूप में.हालाँकि, SPACA6 और IZUMO1 के काज क्षेत्र में व्यापक हाइड्रोजन बॉन्डिंग और इलेक्ट्रोस्टैटिक नेटवर्क के बावजूद, IZUMO137,43,44 की कई स्वीकृत संरचनाओं के संरेखण में आंतरिक लचीलेपन का प्रमाण देखा जा सकता है।अलग-अलग डोमेन का संरेखण अच्छी तरह से ओवरलैप हुआ, लेकिन एक दूसरे के सापेक्ष डोमेन का अभिविन्यास केंद्रीय अक्ष से 50° से 70° तक भिन्न था (चित्र S16)।समाधान में SPACA6 की गठनात्मक गतिशीलता को समझने के लिए, SAXS प्रयोग किए गए (चित्र S17a,b)।SPACA6 एक्टोडोमेन का प्रारंभिक पुनर्निर्माण एक रॉड क्रिस्टल संरचना (छवि S18) के अनुरूप है, हालांकि क्रैटकी प्लॉट ने कुछ हद तक लचीलापन दिखाया (छवि S17b)।यह संरचना IZUMO1 के विपरीत है, जिसमें अनबाउंड प्रोटीन जाली और समाधान43 दोनों में एक बूमरैंग आकार ग्रहण करता है।
विशेष रूप से लचीले क्षेत्र की पहचान करने के लिए, SPACA6 पर हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज मास स्पेक्ट्रोस्कोपी (H-DXMS) का प्रदर्शन किया गया और IZUMO143 (छवि 7 ए, बी) पर पहले प्राप्त डेटा के साथ तुलना की गई।SPACA6 स्पष्ट रूप से IZUMO1 की तुलना में अधिक लचीला है, जैसा कि 100,000 सेकंड के आदान-प्रदान के बाद पूरे ढांचे में उच्च ड्यूटेरियम विनिमय से प्रमाणित होता है।दोनों संरचनाओं में, काज क्षेत्र का सी-टर्मिनल भाग उच्च स्तर का आदान-प्रदान दिखाता है, जो संभवतः एक दूसरे के सापेक्ष 4HB और Ig-जैसे डोमेन के सीमित रोटेशन की अनुमति देता है।दिलचस्प बात यह है कि SPACA6 हिंज का C-टर्मिनल भाग, जिसमें 147CDLPLDCP154 अवशेष शामिल हैं, एक अत्यधिक संरक्षित क्षेत्र 3 (छवि 6 बी) है, जो संभवतः संकेत देता है कि इंटरडोमेन लचीलापन SPACA6 की एक विकसित रूप से संरक्षित विशेषता है।लचीलेपन विश्लेषण के अनुसार, सीडी थर्मल मेल्ट डेटा से पता चला कि SPACA6 (Tm = 51.2°C) IZUMO1 (Tm = 62.9°C) (चित्र S1e और S19) से कम स्थिर है।
SPACA6 और b IZUMO1 की a H-DXMS छवियां।संकेतित समय बिंदुओं पर प्रतिशत ड्यूटेरियम विनिमय निर्धारित किया गया था।हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम विनिमय के स्तर को नीले (10%) से लाल (90%) तक क्रमिक पैमाने पर रंग द्वारा दर्शाया जाता है।ब्लैक बॉक्स उच्च विनिमय के क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करते हैं।क्रिस्टल संरचना में देखी गई 4HB, हिंज और आईजी-जैसे डोमेन की सीमाएं प्राथमिक अनुक्रम के ऊपर दिखाई गई हैं।10 सेकेंड, 1000 सेकेंड और 100,000 सेकेंड पर ड्यूटेरियम विनिमय स्तर को SPACA6 और IZUMO1 की पारदर्शी आणविक सतहों पर लगाए गए एक स्ट्रिप चार्ट पर प्लॉट किया गया था।50% से कम ड्यूटेरियम विनिमय स्तर वाली संरचनाओं के हिस्से सफेद रंग के होते हैं।50% एच-डीएक्सएमएस एक्सचेंज से ऊपर के क्षेत्र ग्रेडिएंट स्केल में रंगीन होते हैं।
CRISPR/Cas9 और माउस जीन नॉकआउट आनुवंशिक रणनीतियों के उपयोग से शुक्राणु और अंडे के बंधन और संलयन के लिए महत्वपूर्ण कई कारकों की पहचान हुई है।IZUMO1-JUNO और CD9 संरचना की सुस्पष्ट अंतःक्रिया के अलावा, युग्मक संलयन से जुड़े अधिकांश प्रोटीन संरचनात्मक और कार्यात्मक रूप से रहस्यमय बने रहते हैं।SPACA6 का जैवभौतिकीय और संरचनात्मक लक्षण वर्णन निषेचन के दौरान आसंजन/संलयन आणविक पहेली का एक और हिस्सा है।
SPACA6 और IST सुपरफैमिली के अन्य सदस्य स्तनधारियों के साथ-साथ व्यक्तिगत पक्षियों, सरीसृपों और उभयचरों में अत्यधिक संरक्षित प्रतीत होते हैं;वास्तव में, ऐसा माना जाता है कि जेब्राफिश 59 में निषेचन के लिए SPACA6 की भी आवश्यकता होती है। यह वितरण अन्य ज्ञात युग्मक संलयन-संबंधित प्रोटीन जैसे DCST134, DCST234, FIMP31 और SOF132 के समान है, जो बताता है कि ये कारक HAP2 की कमी वाले हैं (भी) GCS1) प्रोटीन के रूप में जाना जाता है जो कई प्रोटिस्टों की उत्प्रेरक गतिविधि के लिए जिम्मेदार है।, पौधे, और आर्थ्रोपोड।निषेचित संलयन प्रोटीन 60, 61। SPACA6 और IZUMO1 के बीच मजबूत संरचनात्मक समानता के बावजूद, इनमें से किसी भी प्रोटीन को एन्कोडिंग करने वाले जीन के नॉकआउट के परिणामस्वरूप नर चूहों में बांझपन हुआ, यह दर्शाता है कि युग्मक संलयन में उनके कार्यों की नकल नहीं की जाती है।.अधिक मोटे तौर पर, संलयन के आसंजन चरण के लिए आवश्यक कोई भी ज्ञात शुक्राणु प्रोटीन अनावश्यक नहीं है।
यह एक खुला प्रश्न बना हुआ है कि क्या SPACA6 (और IST सुपरफैमिली के अन्य सदस्य) इंटरगैमेटिक जंक्शनों में भाग लेते हैं, महत्वपूर्ण प्रोटीन को संलयन बिंदुओं पर भर्ती करने के लिए इंट्रागैमेटिक नेटवर्क बनाते हैं, या शायद मायावी फ़्यूज़ोजेन के रूप में भी कार्य करते हैं।HEK293T कोशिकाओं में सह-प्रतिरक्षी अवक्षेपण अध्ययन से पूर्ण लंबाई वाले IZUMO1 और SPACA632 के बीच परस्पर क्रिया का पता चला।हालाँकि, हमारे पुनः संयोजक एक्टोडोमेंस ने इन विट्रो में बातचीत नहीं की, जिससे पता चलता है कि नोडा एट अल में देखी गई बातचीत।दोनों को निर्माण में हटा दिया गया था (IZUMO1 की साइटोप्लाज्मिक पूंछ पर ध्यान दें, जिसे निषेचन62 के लिए अनावश्यक दिखाया गया है)।वैकल्पिक रूप से, IZUMO1 और/या SPACA6 को विशिष्ट बाध्यकारी वातावरण की आवश्यकता हो सकती है जिसे हम इन विट्रो में पुन: पेश नहीं करते हैं, जैसे कि शारीरिक रूप से विशिष्ट संरचनाएं या अन्य प्रोटीन युक्त आणविक परिसर (ज्ञात या अभी तक खोजे नहीं गए)।हालाँकि माना जाता है कि IZUMO1 एक्टोडोमैन पेरिविटेलिन स्पेस में अंडे के लिए शुक्राणु के लगाव में मध्यस्थता करता है, SPACA6 एक्टोडोमैन का उद्देश्य स्पष्ट नहीं है।
SPACA6 की संरचना से कई संरक्षित सतहों का पता चलता है जो प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन में शामिल हो सकती हैं।सीएक्सएक्ससी मोटिफ (उपरोक्त पैच 1 नामित) के ठीक निकट काज क्षेत्र के संरक्षित हिस्से में कई बाहर की ओर सुगंधित अवशेष हैं जो अक्सर बायोमोलेक्यूल्स के बीच हाइड्रोफोबिक और π-स्टैकिंग इंटरैक्शन से जुड़े होते हैं।आईजी-जैसे डोमेन (क्षेत्र 2) के व्यापक पक्ष अत्यधिक संरक्षित आर्ग और उसके अवशेषों के साथ एक सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए खांचे का निर्माण करते हैं, और इस क्षेत्र के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग पहले युग्मक संलयन 30 को अवरुद्ध करने के लिए किया गया है।एंटीबॉडी रैखिक एपिटोप 212RIRPAQLTHRGTFS225 को पहचानता है, जिसमें छह आर्गिनिन अवशेषों में से तीन और अत्यधिक संरक्षित His220 हैं।यह स्पष्ट नहीं है कि क्या शिथिलता इन विशिष्ट अवशेषों या पूरे क्षेत्र की रुकावट के कारण है।β-सैंडविच के सी-टर्मिनस के पास इस अंतर का स्थान पड़ोसी शुक्राणु प्रोटीन के साथ सीआईएस-इंटरैक्शन को इंगित करता है, लेकिन ओओसाइट प्रोटीन के साथ नहीं।इसके अलावा, काज के भीतर एक अत्यधिक लचीली प्रोलाइन-समृद्ध उलझन (साइट 3) की अवधारण प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की साइट हो सकती है या, अधिक संभावना है, दो डोमेन के बीच लचीलेपन की अवधारण का संकेत देती है।SPACA6 की अज्ञात भूमिका के लिए लिंग महत्वपूर्ण है।युग्मकों का संलयन.
SPACA6 में आईजी-जैसे β-सैंडविच सहित अंतरकोशिकीय आसंजन प्रोटीन के गुण हैं।कई चिपकने वाले प्रोटीन (जैसे, कैडेरिन, इंटीग्रिन, चिपकने वाले और IZUMO1) में एक या अधिक β-सैंडविच डोमेन होते हैं जो कोशिका झिल्ली से प्रोटीन को उनके पर्यावरणीय लक्ष्य63,64,65 तक विस्तारित करते हैं।एसपीएसीए6 के आईजी-जैसे डोमेन में आमतौर पर आसंजन और सामंजस्य के β-सैंडविच में पाया जाने वाला एक रूपांकन भी शामिल है: β-सैंडविच के सिरों पर समानांतर स्ट्रैंड के दोहरे टुकड़े, जिन्हें मैकेनिकल क्लैंप66 के रूप में जाना जाता है।ऐसा माना जाता है कि यह आकृति कतरनी बलों के प्रति प्रतिरोध को बढ़ाती है, जो अंतरकोशिकीय अंतःक्रिया में शामिल प्रोटीन के लिए मूल्यवान है।हालाँकि, चिपकने वाले पदार्थों की इस समानता के बावजूद, वर्तमान में कोई सबूत नहीं है कि SPACA6 अंडे की सफेदी के साथ परस्पर क्रिया करता है।SPACA6 एक्टोडोमैन JUNO से बंधने में असमर्थ है, और SPACA6-व्यक्त HEK293T कोशिकाएं, जैसा कि यहां दिखाया गया है, ज़ोना 32 की कमी वाले oocytes के साथ मुश्किल से बातचीत करती हैं।यदि SPACA6 अंतरयुग्मक बंधन स्थापित करता है, तो इन अंतःक्रियाओं को पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों की आवश्यकता हो सकती है या अन्य शुक्राणु प्रोटीन द्वारा स्थिर किया जा सकता है।बाद की परिकल्पना के समर्थन में, IZUMO1-कमी वाले शुक्राणु oocytes से बंधते हैं, यह दर्शाता है कि IZUMO1 के अलावा अन्य अणु युग्मक आसंजन चरण 27 में शामिल हैं।
कई वायरल, सेलुलर और विकासात्मक संलयन प्रोटीन में ऐसे गुण होते हैं जो फ़्यूज़ोजेन के रूप में उनके कार्य की भविष्यवाणी करते हैं।उदाहरण के लिए, वायरल फ्यूजन ग्लाइकोप्रोटीन (कक्षा I, II और III) में प्रोटीन के अंत में एक हाइड्रोफोबिक फ्यूजन पेप्टाइड या लूप होता है जिसे मेजबान झिल्ली में डाला जाता है।IZUMO143 के हाइड्रोफिलिसिटी मानचित्र और IST सुपरफैमिली की संरचना (निर्धारित और अनुमानित) में कोई स्पष्ट हाइड्रोफोबिक संलयन पेप्टाइड नहीं दिखा।इस प्रकार, यदि आईएसटी सुपरफैमिली में कोई प्रोटीन फ़्यूज़ोजेन के रूप में कार्य करता है, तो वे अन्य ज्ञात उदाहरणों से भिन्न तरीके से ऐसा करते हैं।
निष्कर्षतः, युग्मक संलयन से जुड़े प्रोटीन के आईएसटी सुपरफैमिली के सदस्यों के कार्य एक रहस्यमय रहस्य बने हुए हैं।हमारा विशिष्ट SPACA6 पुनः संयोजक अणु और इसकी सुलझी हुई संरचना इन साझा संरचनाओं के बीच संबंधों और युग्मक लगाव और संलयन में उनकी भूमिका के बारे में जानकारी प्रदान करेगी।
अनुमानित मानव SPACA6 एक्टोडोमैन (NCBI परिग्रहण संख्या NP_001303901.1; अवशेष 27-246) के अनुरूप डीएनए अनुक्रम को ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर S2 कोशिकाओं में अभिव्यक्ति के लिए कोडन-अनुकूलित किया गया था और अनुक्रम एन्कोडिंग कोजैक (यूरोफिन्स जीनोमिक्स) के साथ जीन टुकड़े के रूप में संश्लेषित किया गया था।, BiP स्राव संकेत और संबंधित 5′ और 3′ इस जीन के बंधाव-स्वतंत्र क्लोनिंग के लिए एक पीएमटी अभिव्यक्ति वेक्टर में समाप्त होता है, जो प्यूरोमाइसिन (पीएमटी-प्यूरो) के साथ चयन के लिए संशोधित मेटालोथायोनीन प्रमोटर पर आधारित है।पीएमटी-प्यूरो वेक्टर एक थ्रोम्बिन क्लीवेज साइट को एनकोड करता है जिसके बाद 10x-हिज़ सी-टर्मिनल टैग (चित्र S2) होता है।
डी. मेलानोगास्टर S2 (गिब्को) कोशिकाओं में SPACA6 pMT-प्यूरो वेक्टर का स्थिर ट्रांसफ़ेक्शन IZUMO1 और JUNO43 के लिए उपयोग किए गए प्रोटोकॉल के समान ही किया गया था।S2 कोशिकाओं को पिघलाया गया और श्नाइडर के माध्यम (गिब्को) में 10% (v/v) ताप-निष्क्रिय भ्रूण बछड़ा सीरम (गिब्को) और 1X एंटीमायोटिक एंटीबायोटिक (गिब्को) की अंतिम सांद्रता के साथ विकसित किया गया।प्रारंभिक मार्ग कोशिकाओं (3.0 x 106 कोशिकाओं) को 6-वेल प्लेटों (कॉर्निंग) के व्यक्तिगत कुओं में चढ़ाया गया था।27°C पर 24 घंटे के ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं को निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार SPACA6 pMT-puro वेक्टर और इफ़ेक्टेन ट्रांसफ़ेक्शन अभिकर्मक (क्यूजेन) के 2 मिलीग्राम के मिश्रण से ट्रांसफ़ेक्ट किया गया।ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को 72 घंटों के लिए ऊष्मायन किया गया और फिर 6 मिलीग्राम/एमएल पौरोमाइसिन के साथ काटा गया।फिर कोशिकाओं को पूर्ण श्नाइडर माध्यम से अलग किया गया और बड़े पैमाने पर प्रोटीन उत्पादन के लिए सीरम मुक्त कीट-एक्सप्रेस माध्यम (लोन्ज़ा) में रखा गया।S2 सेल कल्चर के 1 L बैच को 2 L हवादार फ्लैट-बॉटम पॉलीप्रोपाइलीन एर्लेनमेयर फ्लास्क में 8-10 × 106 ml-1 कोशिकाओं तक बढ़ाया गया और फिर 500 µM CuSO4 (मिलिपोर सिग्मा) की अंतिम सांद्रता के साथ निष्फल किया गया और बाँझ फ़िल्टर किया गया।प्रेरित.प्रेरित संस्कृतियों को चार दिनों के लिए 27 डिग्री सेल्सियस पर 120 आरपीएम पर ऊष्मायन किया गया था।
SPACA6 युक्त वातानुकूलित माध्यम को 5660×g पर 4°C पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा अलग किया गया था, इसके बाद 10 kDa MWCO झिल्ली के साथ सेंट्रामेट स्पर्शरेखा प्रवाह निस्पंदन सिस्टम (पाल कॉर्प) लगाया गया था।SPACA6 युक्त सांद्रित माध्यम को 2 मिली Ni-NTA अगारोज रेजिन (क्यूजेन) कॉलम पर लगाएं।नी-एनटीए राल को बफर ए के 10 कॉलम वॉल्यूम (सीवी) के साथ धोया गया था और फिर 50 मिमी की अंतिम इमिडाज़ोल एकाग्रता देने के लिए बफर ए का 1 सीवी जोड़ा गया था।SPACA6 को 500 mM की अंतिम सांद्रता तक इमिडाज़ोल के साथ पूरक 10 मिलीलीटर बफर ए के साथ मिलाया गया था।डायलिसिस के लिए प्रतिबंध वर्ग थ्रोम्बिन (मिलिपोर सिग्मा) को सीधे डायलिसिस टयूबिंग (एमडब्ल्यूसीओ 12-14 केडीए) में 1 यूनिट प्रति मिलीग्राम एसपीएसीए6 बनाम 1 एल 10 मिमी ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.5 और 150 मिमी NaCl (बफर बी) में जोड़ा गया था।) 48 घंटों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर।नमक की सघनता को कम करने के लिए थ्रोम्बिन-क्लीव्ड SPACA6 को तीन गुना पतला किया गया और 10 मिमी ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.5 के साथ संतुलित 1 मिलीलीटर मोनोएस 5/50 जीएल कटियन एक्सचेंज कॉलम (सिटिवा/जीई) पर लोड किया गया।कटियन एक्सचेंजर को 10 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.5 के 3 सीवी के साथ धोया गया था, फिर एसपीएसीए6 को 25 सीवी के लिए 10 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.5 में 0 से 500 एमएम NaCl के रैखिक ढाल के साथ धोया गया था।आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी के बाद, SPACA6 को 1 मिलीलीटर तक केंद्रित किया गया था और बफर बी के साथ संतुलित एक एनरिच SEC650 10 x 300 कॉलम (बायोरैड) से आइसोक्रैटिक रूप से उत्सर्जित किया गया था। क्रोमैटोग्राम के अनुसार, SPACA6 युक्त अंशों को पूल और केंद्रित करें।16% एसडीएस-पॉलीएक्रिलामाइड जेल पर कूमैसी-सना हुआ इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा शुद्धता को नियंत्रित किया गया था।बीयर-लैंबर्ट कानून और सैद्धांतिक दाढ़ विलुप्त होने के गुणांक का उपयोग करके 280 एनएम पर अवशोषण द्वारा प्रोटीन एकाग्रता की मात्रा निर्धारित की गई थी।
शुद्ध SPACA6 को रात भर 10 mM सोडियम फॉस्फेट, pH 7.4 और 150 mM NaF के विरुद्ध डायलाइज़ किया गया और CD स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण से पहले 0.16 mg/mL तक पतला किया गया।185 से 260 एनएम की तरंग दैर्ध्य वाली सीडी की स्पेक्ट्रल स्कैनिंग को जैस्को जे-1500 स्पेक्ट्रोपोलिमीटर पर 50 एनएम/मिनट की दर से 25 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिमी ऑप्टिकल पथ लंबाई (हेल्मा) के साथ क्वार्ट्ज क्यूवेट्स का उपयोग करके एकत्र किया गया था।सीडी स्पेक्ट्रा को बेसलाइन सही किया गया, औसतन 10 से अधिक अधिग्रहण किए गए, और डिग्री सेमी2/डीएमओएल में औसत अवशिष्ट अण्डाकारता (θMRE) में परिवर्तित किया गया:
जहां MW दा में प्रत्येक नमूने का आणविक भार है;एन अमीनो एसिड की संख्या है;θ मिलीमीटर में अण्डाकारता है;d सेमी में ऑप्टिकल पथ की लंबाई से मेल खाता है;इकाइयों में प्रोटीन सांद्रता.